SNT2653-2010-木瓜中轉(zhuǎn)基因成分定性PCR檢測(cè)方法.pdf

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1、版權(quán)所有·禁止翻制、電子發(fā)售中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)!"!#!"#$"!%&%木瓜中轉(zhuǎn)基因成分定性$%&檢測(cè)方法$'()(*(+(,)-./01+2)1)23.4(+56.'17.*-128'.1*)2(8!$%&",('9.).*)28::.8.)2*1++56(92,2.9*(64(8.8)28414151!%&%;&&;%&發(fā)布!%&&;%#;%&實(shí)施中華人民共和國(guó)發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局犛犖／犜２６５３—２０１０版權(quán)所有·禁止翻制、電子發(fā)售前言本標(biāo)準(zhǔn)按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)

2、由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、中華人民共和國(guó)深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳紅運(yùn)、陳雙雅、梁新苗、康林、葉正清、李玲、朱水芳、陳洪俊。Ⅰ犛犖／犜２６５３—２０１０版權(quán)所有·禁止翻制、電子發(fā)售木瓜中轉(zhuǎn)基因成分定性犘犆犚檢測(cè)方法１范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了木瓜中轉(zhuǎn)基因成分的定性ＰＣＲ檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于抗病毒轉(zhuǎn)基因木瓜的定性檢測(cè)。２規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，

3、僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法ＳＮ／Ｔ１１９３基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求ＳＮ／Ｔ１１９４植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)抽樣和制樣方法３縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。ＣＰ（ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ）：外殼蛋白基因ＣａＭＶ３５Ｓ（３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒｆｒｏｍｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）：來自于花椰菜花葉病毒的３５Ｓ啟動(dòng)子ＧＭＹＫ：ＰＲＳＶＹＫ株系ＣＰ基因介導(dǎo)的抗病毒轉(zhuǎn)基因木瓜品系ＮＰＴＩＩ（ｎｅｏｍｙ

4、ｃｉｎ３′ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅ）：新霉素３’磷酸轉(zhuǎn)移酶基因ＮＯＳ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｏｆｎｏｐａｌｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ）：胭脂堿合成酶基因終止子ＰＲＳＶ（Ｐａｐａｙａｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ）：木瓜環(huán)斑病毒Ｐａｐａｉｎ：木瓜蛋白酶基因，木瓜內(nèi)源基因Ｒｅｐ（ｒｅｐｌｉｃａｓｅｇｅｎｅ）：復(fù)制酶基因５５１／６３１：ＰＲＳＶＨＡ５１株系ＣＰ基因介導(dǎo)的抗病毒轉(zhuǎn)基因木瓜品系華農(nóng)１號(hào)：ＰＲＳＶＲｅｐ基因介導(dǎo)的抗病毒轉(zhuǎn)基因木瓜品系４原理樣品經(jīng)過提?。模危梁螅槍?duì)轉(zhuǎn)基因植物所插入的外源基

5、因的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過ＰＣＲ技術(shù)，特異性擴(kuò)增外源基因的ＤＮＡ片斷，根據(jù)ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果，判斷該樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。５試劑和儀器５．１試劑除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。水為ＧＢ／Ｔ６６８２規(guī)定的一級(jí)水。５．１．１１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ緩沖液（ｐＨ８．０）：稱?。保玻保保纾裕颍椋螅苡冢福埃埃恚趟?，攪拌，加入濃鹽酸４２ｍＬ，冷卻至室溫，用稀鹽酸準(zhǔn)確調(diào)整ｐＨ至８．０，然后定容至１Ｌ，分裝后高壓滅菌備用。１犛犖／犜２６５３—２０１０版權(quán)所有·禁止翻制、電子發(fā)售５．１．２０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ

6、８．０）：在８００ｍＬ水中加入１８６．１ｇＮａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ，在磁力攪拌器劇烈攪拌，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液ｐＨ值至８．０（約需２０ｇ氫氧化鈉顆粒），然后定容至１Ｌ。分裝后高壓滅菌備用。５．１．３ＤＮＡ提取緩沖液：量取１００ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＣｌ，５０ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，稱?。担埃缡榛妓徕c（ＳＤＳ），１６．８４８ｇ氯化鈉，定容至１Ｌ，分裝滅菌備用。５．１．４ＲＮＡ酶（１０μｇ／ｍＬ）。５．１．５聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）。５．１．６Ｔｒｉｓ飽和酚。５．１．７三氯甲烷。５．１．８異戊醇。５．１．９異

7、丙醇。５．１．１０７０％乙醇。５．１．１１ＴＥ緩沖液：分別加入１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＬ和０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液２ｍＬ，定容至１Ｌ。在１０３．４ｋＰａ（１２１℃）條件下滅菌２０ｍｉｎ。５．１．１２犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。５．１．１３ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ。５．１．１４５×ＴＢＥ緩沖液：Ｔｒｉｓ５４ｇ，硼酸２７５ｇ，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍＬ，定容至１Ｌ。５．１．１５瓊脂糖（電泳純）。５．１．１６ＤＮＡ分子量標(biāo)記（１００ｂｐＬａｄｄｅｒ）。

8、５．１．１７溴化乙錠（ＥＢ）或其他染色劑。５．１．１８引物：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因木瓜內(nèi)、外源基因的引物及其信息見表１。表１檢測(cè)轉(zhuǎn)基因木瓜內(nèi)、外源基因所需的引物信息擴(kuò)增長(zhǎng)度檢測(cè)基因來源引物序列（上游／下游）提示備注ｂｐ５’ｔｇｃｔｔｇａｃｔｇｃｇａｃａｇａｃ３’Ｐａｐａｉｎ內(nèi)源１４４木瓜內(nèi)源基因５’ｃｔｔｔｃ