鮭魚降鈣素與降鈣素基因相關(guān)肽基因原核表達(dá)的-研究

《鮭魚降鈣素與降鈣素基因相關(guān)肽基因原核表達(dá)的-研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文間內(nèi)抑制破骨細(xì)胞的活性，在長時間內(nèi)則能抑制破骨細(xì)胞的增生，從而減少其數(shù)量，達(dá)到抑制骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)換的目的【201。目前認(rèn)為，降鈣素對破骨細(xì)胞的作用是借助子破骨細(xì)胞膜上的降鈣素受體，其基因的多態(tài)性與骨密度有關(guān)‘2¨。③調(diào)節(jié)鈣磷水平。降鈣素能抑制腎臟對鈣、磷的重吸收，增加鈣、磷排泄，降低血鈣，還可以增加鈉和氯的排泄。另外，低劑量的降鈣素還可以抑制腸鈣的吸收‘201。④止痛。研究發(fā)現(xiàn)，在大腦調(diào)節(jié)痛覺的區(qū)域中，降鈣素的結(jié)合位點不同于降鈣素基因相關(guān)肽的結(jié)合位點，因此，降鈣素可能直接調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的痛覺[221。另外，降鈣素可以改變神經(jīng)元的鈣

2、離子流，作用在特異的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛受體上，抑制疼痛，刺激垂體對p。內(nèi)啡肽的釋放，阻斷痛覺的傳導(dǎo)和對腦下丘體的影響，直接調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的受傷害感受作用口31。降鈣素可以增加促腎上腺激素的分泌，也能調(diào)節(jié)前列腺素的代謝，具有外周止痛的作用f20l。并且，研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素對于骨質(zhì)疏松性骨折或骨骼變形所引起的慢性疼痛以及骨腫瘤等疾病引起的骨痛均具有減輕疼痛的效果剛。由于降鈣素能抑制胃酸分泌，便可用來治療急性胃潰瘍；降鈣素能抑制胰腺激素的分泌及抑制酶的釋放，還可用于治療急性胰腺炎；同時，降鈣素對甲狀旁腺機能的亢進(jìn)也有治療作用1251。此外，降鈣素也可能引發(fā)一些不良反應(yīng)，常

3、見惡心、嘔吐、頭暈，偶見多尿、寒戰(zhàn)【20l，因此，在使用時需要注意調(diào)節(jié)降鈣素的使用劑量。1．1．4降鈣素的研究現(xiàn)狀關(guān)于降鈣素的研究，早在20世紀(jì)70年代就已經(jīng)開始利用固相和液相法進(jìn)行合成降鈣素，但是其合成步驟多，純度差，獲得率低，因此價格十分昂貴。在80年代，國外開展了利用基因工程法生產(chǎn)降鈣素的研究。應(yīng)用基因工程法可以相對比較容易地準(zhǔn)備出所設(shè)計的新型降鈣素，以期獲得活性高，半衰期長，無抗原性的新型降鈣素以供臨床使用1261。有關(guān)降鈣素基因表達(dá)及其表達(dá)宿主的研究，劉穎等㈣已經(jīng)利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)重組鮭魚降鈣素(RecombinantSalmonCalcitonin

4、，rsCT)，探索了一條真第1章緒論核生物表達(dá)重組鮭魚降鈣素的新途徑。Myake及Tajima等也分別報道了利用基因工程法生產(chǎn)降鈣素的研剜28291。Ishikawa應(yīng)用串聯(lián)法表達(dá)人的降鈣素‘301。目前，關(guān)于降鈣素融合蛋白的表達(dá)一般采用將降鈣素與一個大的載體相連接，形成融合蛋白或是進(jìn)行分泌表達(dá)p¨。目前，國內(nèi)有報道把鮭魚降鈣素(SalmonCalcitonin，sCT)基因與載體串聯(lián)，并在TOPl0中表達(dá)串聯(lián)多拷貝基因，既不會使表達(dá)產(chǎn)物降解，又不會引起在進(jìn)行與大分子蛋白融合表達(dá)時，因目的產(chǎn)物只占表達(dá)產(chǎn)物的一小部分而使產(chǎn)率下降的問題【261。影響外源蛋白表達(dá)的因素有

5、很多，其中，在誘導(dǎo)表達(dá)時保證細(xì)菌旺盛的生長狀態(tài)是很重要的，另外，保證在大腸桿菌代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)(主要是乙酸)的較低含量也不容忽視【32J。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們常利用金屬螯合層析技術(shù)【3習(xí)對目的蛋白進(jìn)行分離純化，該技術(shù)就是在目的蛋白序列中添加一段短肽序列作為標(biāo)簽，該標(biāo)簽含有6個組氨酸，即組氨酸標(biāo)簽，使其具有與金屬離子螯合的共同性質(zhì)。由于組氨酸標(biāo)簽序列很短，對目的蛋白的性質(zhì)影響較小，因此，所得到的目的蛋白可以直接用于蛋白的功能研究或進(jìn)行抗體的制備1261。另外，還可以根據(jù)融合蛋白中配體蛋白的性質(zhì)來設(shè)計親和層析介質(zhì)，利用親和層析的方法來達(dá)到分

6、離該融合蛋白的目的【34,351。常用的pGEX表達(dá)載體中的配體蛋白是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，利用其底物谷胱甘肽固定于樹脂上，可以作為親和層析法分離純化融合蛋白的介質(zhì)【36】。美國PharmaGenetics公司應(yīng)用基因工程法生產(chǎn)鮭魚降鈣素，用pGEX質(zhì)粒作為表達(dá)載體，將降鈣素分子與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。融合蛋白用G—Sepharose，4B柱進(jìn)行親和層析純化，BrCN裂解融合蛋白，再用u．AE酶使C一末端產(chǎn)生脯氨酰胺，利用HPLC純化得到降鈣素，收率可以達(dá)到85％以上【371。目前，國內(nèi)也已有人用Thiobind親和樹脂進(jìn)行純化表達(dá)的融合蛋白，融合蛋白

7、的純度達(dá)到90％12叫。另外，PharmaGenetics公司還成功構(gòu)建了a．AE的表達(dá)質(zhì)粒，Gt．AE酶的使用將加速利用基因工程法生產(chǎn)降鈣素的進(jìn)程p引。此外，越來越多的研究顯示，降鈣素的組織發(fā)生、細(xì)胞生長、分化及生存方面也發(fā)揮著重要的作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，關(guān)于降鈣素相耦聯(lián)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的研究亦在不斷的擴展和深入Il引。目前降鈣素的臨床引用還很局黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文限，主要用于治療骨質(zhì)疏松、Paget’S病及腫瘤性的高血鈣癥，其中關(guān)于降鈣素抑制骨吸收及鎮(zhèn)痛的作用已經(jīng)明確，在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的治療中已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)同，但是，國