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《rna激活介導(dǎo)e-鈣粘蛋白上調(diào)表達(dá)抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、浙江人學(xué)博I：學(xué)位論義中文摘要RNA激活介導(dǎo)E．鈣粘蛋白上調(diào)表達(dá)的抗腫瘤作用及其機(jī)制研究浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士研究生導(dǎo)師中文摘要外科學(xué)(泌尿外科)毛祺琦謝立平第一部分小激活RNA的設(shè)計(jì)與篩選目的基于小激活RNAs(saRNAs)的腫瘤治療策略，為p12、p27、p57三個(gè)抑癌基因篩選出具有激活功能并相對(duì)高效的候選saRNAs分子。方法利用國(guó)外文獻(xiàn)提供的saRNA設(shè)計(jì)規(guī)則，為每個(gè)靶基因設(shè)計(jì)2～3對(duì)候選saRNA分子，對(duì)照組雙鏈RNA設(shè)計(jì)成與人基因組序列非同源。將上述合成的候選saRNAs分子轉(zhuǎn)染膀胱癌5637、T24細(xì)胞系或前列腺癌P
2、C3、DUl45細(xì)胞系，每一種細(xì)胞系均包括對(duì)照組(轉(zhuǎn)染對(duì)照組saRNAs)和saRNAs組(轉(zhuǎn)染候選saRNAs)．利用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后靶基因mRNA表達(dá)水平，根據(jù)靶基因表達(dá)水平篩選出功能性saRNAs，我們將“功能性saRNAs”定義為使靶基因mRNA表達(dá)量增加至少兩倍(RT-PCR法)。．結(jié)果轉(zhuǎn)染各候選saRNAs后各靶基因mRNA的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組無(wú)明顯增強(qiáng)，沒(méi)有達(dá)到“功能性saRNAs”的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論saRNAs的篩選還比較困難，其設(shè)計(jì)規(guī)則有待進(jìn)一步完善。浙江大學(xué)博t：學(xué)位論文中j[摘要第二部分E．鈣粘蛋白小激
3、活RNA的抗腫瘤作用目的評(píng)價(jià)已證實(shí)的E．鈣粘蛋白(E．cadherin)小激活RNA(dsEcad一215)對(duì)膀胱癌5637細(xì)胞及前列腺癌PC3細(xì)胞的腫瘤抑制作用。方法將與E—cadherin基因啟動(dòng)子DNA序列互補(bǔ)的雙鏈RNA分子(dsEcad．215)分別轉(zhuǎn)染入5637細(xì)胞和PC3細(xì)胞中，采用RT-PCR法及Westernblotting法檢測(cè)E．cadherin在mRNA及蛋白水平上的表達(dá)；采用Transwell小室法及劃痕法檢測(cè)dsEcad-215轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力的改變。結(jié)果dsEcad．215轉(zhuǎn)染5637細(xì)
4、胞和PC3細(xì)胞72h后E．cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，RNAa有效；5637細(xì)胞和PC3細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲能力及遷移能力也明顯下降。結(jié)論RNAa技術(shù)激活E．cadherin基因表達(dá)并抑制膀胱癌及前列腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為，可作為惡性腫瘤基因治療的一種有效手段。第三部分小激活RNA上調(diào)E．鈣粘蛋白表達(dá)的機(jī)制研究目的探討dsEcad．215上調(diào)E．cadherin基因表達(dá)的相關(guān)分子機(jī)制方法采用基因特異性RT-PCR檢測(cè)5637細(xì)胞E．cadherin啟動(dòng)子相關(guān)非編碼正義或反義RNA的表達(dá)，以及dsEcad一215轉(zhuǎn)染后其
5、表達(dá)量的變化；利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)dsEcad．215轉(zhuǎn)染后E—cadherin啟動(dòng)子區(qū)域相關(guān)組蛋白修飾狀態(tài)的變化；采用RT-PCR法檢測(cè)dsEcad．215作用后干擾素通路OASl及OAS3基因表達(dá)的變化。結(jié)果E．cadherin啟動(dòng)子區(qū)域存在非編碼正義和反義RNA；dsEcad．215轉(zhuǎn)染后E．cadherin啟動(dòng)子相關(guān)非編碼反義和反義RNA的表達(dá)未發(fā)生明顯變化，E．cadherin啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白3賴氨酸9(H3K9)和組蛋白3賴氨酸4(H3K4)二甲基化的水平明顯降低，干擾素通路中OASl和OAS3基因的表達(dá)沒(méi)有
6、明顯升高。結(jié)論dsEcad．215轉(zhuǎn)染5637細(xì)胞后并沒(méi)有影響非編碼正義和反義RNA的表達(dá)水平，而可能與其結(jié)合后改變其空間結(jié)構(gòu)和功能從而影響組蛋白甲基化的修飾，如III浙江人學(xué)博I：學(xué)位論文中文摘要H3K9和H3K4兩個(gè)位點(diǎn)二甲基化水平減弱而激活轉(zhuǎn)錄。dsEcad一215沒(méi)有激活干擾素途徑而誘發(fā)非特異性反應(yīng)。第四部分小激活RNA上調(diào)E．鈣粘蛋白表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移的機(jī)制研究目的探討E—cadherin上調(diào)表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移的相關(guān)分子機(jī)制方法利用Westernblot檢測(cè)Ecad一215轉(zhuǎn)染后13-catenin蛋白
7、在膀胱癌5637細(xì)胞及前列腺癌PC3細(xì)胞胞膜、胞漿及胞核中表達(dá)變化；利用細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)一步驗(yàn)證13-eatenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的重新分布；利用RT-PCR法檢測(cè)mmp-7及cyclinD1基因mRNA的表達(dá)水平．結(jié)果dsEcad一215轉(zhuǎn)染5637及PC3細(xì)胞?2h后，細(xì)胞質(zhì)和胞核13-eatenin蛋白表達(dá)水平降低，胞膜肛catenin蛋白表達(dá)水平升高，而總的蛋白表達(dá)水平不變；細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)dsEcad．215作用后13-catenin蛋白從胞質(zhì)、胞核重新分布于細(xì)胞膜上．mmp．7和cycylinD1基因mRNA
8、表達(dá)水平降低．結(jié)論dsEcad一215上調(diào)E—cadherin表達(dá)，引起lB-catenin蛋白從胞核胞漿轉(zhuǎn)移至胞膜，導(dǎo)致其靶基因轉(zhuǎn)錄活性降低，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲。關(guān)鍵詞：RNA激活；E-鈣粘蛋白；膀胱癌；前列腺癌；侵襲IV浙江大學(xué)博t學(xué)位論近英義摘要Stud
