乙型腦炎病毒ns1蛋白單克隆抗體制備與其表位的鑒定(7068)

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1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得河北農(nóng)業(yè)太堂一或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：j≯互手于簽字日期：．知『f年f月多日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解洹j匕壅些太堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)邐j匕壅些太堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容

2、編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名：爻歹支仟導(dǎo)師簽名：簽字日期：2．，Jf年‘月夕日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通訊地址：仇以’釓簽字日期：≯、7年6月>日電話：郵編：摘要流行性乙型腦炎(Japaneseencephalitis，JE)是由黃病毒科黃病毒屬的乙型腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)引起的一種以蚊蟲為媒介傳播的人和動物共患的病毒性疾?。倚湍X炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)與西尼羅病毒(WestNilev

3、irus，WNV)、圣路易腦炎病毒(Saint．Louisencephalitisvirus，SLEV)和墨累河谷腦炎病毒(MurrayValleyencephalitisvirus，MVEV)同屬一個(gè)血清群。上述病原可導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，而且其中的兩種或多種病原往往在同一地區(qū)流行，加之它們在血清學(xué)上存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，所以建立起針對上述病原的快速、可靠的鑒別診斷方法十分必要。本研究以本實(shí)驗(yàn)室保存的SAl4．14．2株NSl基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，由人工合成，將NSl基因分別亞克隆至原核表達(dá)載體pET-30和pMAL．e5X構(gòu)建出重組質(zhì)粒pET-30．opti．NSl和pc5X．opti

4、．NSl。將pET-30．opti．NSl重組質(zhì)粒驗(yàn)證連接正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將表達(dá)產(chǎn)物純化作為免疫原，免疫6周齡BALB／c小鼠；經(jīng)過免疫、融合、篩選等過程，共獲得16株特異性針對NSl蛋白的單克隆抗體，IFA表明其中8株能識別天然狀態(tài)下的NSl蛋白；將pc5X．opti．NSl重組質(zhì)粒驗(yàn)證連接正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞ER2523，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS．PAGE分析結(jié)果顯示重組的NSl蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中得到大量表達(dá)，并部分以可溶形式存在。Westernblot和間接ELISA檢測表明該重組NSl蛋白能與豬JEV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

5、以pc5X．opti-NSl表達(dá)的MBP—NSl蛋白為檢測用抗原，建立間接ELISA檢測方法篩選分泌NSl蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。設(shè)計(jì)一套包含整個(gè)NSl蛋白的51個(gè)短肽片段，每個(gè)肽段長度為16aa，每兩個(gè)相鄰的短肽之間有8aa的重疊。為表達(dá)這些短肽，首先人工合成了表達(dá)它們的基因，在編碼鏈的5’端引入BamHI位點(diǎn)，3’端引入XhoI位點(diǎn)。這51個(gè)肽段經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后得到了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物與制備的單克隆抗體100816．10F7、100816．885、100910．1E8、100816．7G1、100816．4E3、100910．6D8作用，ELISA結(jié)果與單抗100816．10F7、10

6、0816．885、100910．1E8、100816．7Gl、100816-4E3、100910．6D8呈現(xiàn)明顯的陽性反應(yīng)，由此可以判定單抗的抗原表位，分別將該區(qū)域逐一氨基酸截短表達(dá)后與對應(yīng)單抗反應(yīng)，結(jié)果表明5AIDITRKll、72RDELNVL78、227ETHTL，W232、251KSKHNRREGY260、269DENGIVLD276、341DETTLVRS348序列為該表位的核心序列。關(guān)鍵詞：乙型腦炎病毒；NSl蛋白；單克隆抗體；表位]PreparationofMonoclonalAntibodiesagainstNS1ProteinofJapaneseencephalitisv

7、irusandIdentificationofB—cellEpitopesMastercandidate：LikeLiuAdvisor：Prof．YuhongRenProf．RonghongHuaMajor：BasicVeterinaryMedicineAbstractJapaneseencephalitisvirus(JEV)，beingamemberofthefamilyFlaviviridae，iSusuallyi