兩個(gè)養(yǎng)殖海區(qū)與櫛孔扇貝消化盲囊細(xì)菌群落多樣性的分析

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1、兩種不同扇貝養(yǎng)殖模式海區(qū)及櫛孔扇貝消化盲囊細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)季節(jié)性變化兩個(gè)養(yǎng)殖海區(qū)及櫛孔扇貝消化盲囊細(xì)菌群落多樣性分析摘要細(xì)菌是海區(qū)生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，本研究為了解單一養(yǎng)殖模式與貝藻混養(yǎng)模式下的扇貝養(yǎng)殖海區(qū)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)性變化以及不同模式下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的異同，運(yùn)用PCR．DGGE技術(shù)對(duì)沙子口和桑溝灣2種不同養(yǎng)殖模式海區(qū)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了分析。連續(xù)7個(gè)月(2009年5-11月)和11個(gè)月(2009年5月～2010年4月，2月除外)分別定點(diǎn)采集桑溝灣和沙子口養(yǎng)殖海區(qū)水深O．5111和3m處的水樣，過濾收

2、集粒徑在0．22~3pm的微生物，采用CTAB-法提取樣品總DNA，擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNAV3~V5可變區(qū)序列，并通過變性梯度凝膠電泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)技術(shù)對(duì)所得序列進(jìn)行分離，采用軟件QuantityOne和SensiAnsys進(jìn)行DGGE指紋圖譜分析。試驗(yàn)結(jié)果如下：1)桑溝灣海區(qū)DGGE圖譜共得到231條條帶，其中處于不同位置的條帶數(shù)為26條，每個(gè)月份條帶數(shù)在14~23之間，平均數(shù)為19．41。同一月份水深0．5m和3m處的細(xì)菌群落組成極

3、為相似(730／o---91％)，不同月份間的細(xì)菌群落差異較大，其中8月份細(xì)菌種類最為豐富。基于各月份DGGE條帶數(shù)目和亮度進(jìn)行UPGMA聚類分析，7個(gè)月份的樣品中，6、7和11月聚為一類，8、9和lO月聚為一類，5月單獨(dú)聚為一支。對(duì)DGGE圖譜中的11條主帶進(jìn)行回收、重?cái)U(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果表明，這11條序列與GenBank中已登錄的細(xì)菌物種同源性在91％-99％之間，同源性分析結(jié)果表明這些序列中，a．變形茵亞門(a-Proteobacteda)、擬桿菌f-j(Baeteroidetes)和放線菌f-j(Aet

4、inobacteria)均占所測(cè)序列的27．3％，B．變形菌亞門和7．變形菌亞門各占9．1％。所分析的11條序列中有l(wèi)O條序列與GenBank中登錄的未成功培養(yǎng)細(xì)菌的序列相似度高。2)沙子口11個(gè)水深0．5m處細(xì)菌樣品(2月除外)的DGGE圖譜共得到198條條帶，其中處于不同位置的條帶數(shù)為36條，每個(gè)月份條帶數(shù)在15-23之間，平均數(shù)為18。其中1月份條帶數(shù)最多，3月份條帶數(shù)最少。UPGMA分析顯示，11個(gè)月份的樣品中，春季(3～5月)聚為一大類，夏季到冬季(6~1月)聚為另一大類。對(duì)20條熒光強(qiáng)度較高的條

5、帶進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)所有序列與數(shù)據(jù)庫中16SrDNA序列兩種不同扇貝養(yǎng)殖模式海區(qū)及櫛孔扇貝消化盲囊細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)季節(jié)性變化的最大相似性在94％--100％之間。獲得的20條序列分屬于4個(gè)門，其中Q．變形菌亞門占所測(cè)序列的35％，p．變形菌亞門和丫．變形菌亞門均占10％，擬桿菌門占25％，放線菌門占15％，疣微菌門(Verrucomicrobia)僅占5％。比對(duì)結(jié)果顯示，20條序列中16條屬于海洋未培養(yǎng)的細(xì)菌克隆。3)為分析櫛孔扇貝消化盲囊內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的周年動(dòng)態(tài)變化，本研究于2009年6月,--2010年6月連續(xù)

6、12個(gè)月每月采集沙子口養(yǎng)殖區(qū)扇貝10只，擴(kuò)增消化盲囊細(xì)菌的16SrDNAV3-V5可變區(qū)序列，并通過PCR．DGGE技術(shù)對(duì)所得序列進(jìn)行分離，采用軟件QuantityOne對(duì)12個(gè)樣品的DGGE圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果共得至1]ll條不同位置的條帶，各個(gè)月份的條帶數(shù)目相似，其中9條條帶作為共有條帶在全年均有分布，占總條帶數(shù)的81．82％。表明櫛孔扇貝消化盲囊群落結(jié)構(gòu)組成相對(duì)穩(wěn)定。選取其中9條熒光強(qiáng)度較高的條帶進(jìn)行測(cè)序，所測(cè)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)16SrDNA序列的最大相似性在97‰99％之間，分屬于變形茵門、放

7、線菌門、厚壁菌門(Firmicutes)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)。其中，B．變形菌亞門占所測(cè)序列的11．1l％，6．變形菌亞門占22．22％，厚壁菌門占22．22％，藍(lán)細(xì)菌門占11．11％，放線菌門占33．33％。4)平板培養(yǎng)方法從健康扇貝消化盲囊中分離到28株菌，經(jīng)16S鑒定主要分屬于弧菌屬(Vibrio)，23株；Tenacibaculum屬，3株；Colwellia屬，1株；Ruegeria屬，l株。選擇其中分屬不同屬的3株菌(E8：啪砌，E14：Ruegeria，E19：Tenaci

8、baculum)進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，每只注射1．7×106個(gè)細(xì)菌，以注射無菌生理鹽水組做對(duì)照。分別在感染后的第ld，3d，5d，7d，9d取樣，測(cè)定血清中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(—U@)和超氧化物歧化酶(SOD)活力，并記錄死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射菌E8(Hbrio)的扇貝10天后的平均死亡率達(dá)到了26．25％，顯著高于對(duì)照(5％)，注射E14菌株扇貝死亡率則稍低于對(duì)照，注射E19菌株，扇貝死亡率稍高于對(duì)照。