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《毛囊細(xì)胞特異表達(dá)胸腺素β4基因轉(zhuǎn)基因絨山羊的的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、術(shù)。自1997年克隆羊“多莉’’的誕生以來，體細(xì)胞克隆技術(shù)成為了動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的熱點(diǎn)，并在家畜的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)研究中被廣泛的應(yīng)用。本研究采用了體細(xì)胞核移植的轉(zhuǎn)基因方法，即以毛囊特異表達(dá)的啟動(dòng)子pKAP6—1引導(dǎo)胸腺素p4(thymosinbeta4，T134)基因，以新霉素抗性基因和紅色熒光蛋白基因作為雙選擇標(biāo)記，構(gòu)建毛囊細(xì)胞中特異性表達(dá)T肛的表達(dá)載體；利用體外轉(zhuǎn)染技術(shù)將表達(dá)載體導(dǎo)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，通過G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的克隆細(xì)胞：以體細(xì)胞核移植技術(shù)制備絨山羊轉(zhuǎn)基因克隆胚胎；并通過
2、胚胎移植，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因絨山羊。本研究為轉(zhuǎn)基因絨山羊的培育，以及探討Tp4在絨山羊毛囊發(fā)育和生長(zhǎng)周期中的調(diào)控作用提供了研究基礎(chǔ)。1．毛囊細(xì)胞特異性表達(dá)載體的構(gòu)建通過PCR和RT．PCR方法分別從綿羊總DNA和絨山羊總RNAq了擴(kuò)增出角蛋白關(guān)聯(lián)蛋86．1基因(KAP6．1)啟動(dòng)子區(qū)序列和絨山羊胸腺素p4(Tp4)編碼區(qū)eDNA序列，以pMDl9T為克隆骨架構(gòu)建成中間克隆載體p19TKT。將CMV啟動(dòng)子序列連接在pDsRed2．1表達(dá)框架的紅色熒光蛋白報(bào)告基因(Red2)上游內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文rpnI+Sm
3、aI位點(diǎn)構(gòu)成pCDsRed2；pCDsRed2經(jīng)SacI+Hind1II酶切，與p19TKT的KT片段連接構(gòu)成毛囊細(xì)胞特異表達(dá)載體pCDsR．KT。2．絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染通過組織塊貼附方法成功分離出絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，利用脂質(zhì)體Lip2000TM將構(gòu)建好的毛囊特異表達(dá)載體pCDsR．KT轉(zhuǎn)入絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞基因組中。再利用G418藥物和紅色熒光蛋白的表達(dá)雙重篩選獲得陽性細(xì)胞克隆，并通過PCR的方法鑒定陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆來源細(xì)胞的胎兒性別和外源基因在細(xì)胞基因組中的整合情況。通過
4、對(duì)轉(zhuǎn)基因／非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系生長(zhǎng)曲線的繪制與染色體數(shù)目的分析，評(píng)估轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活性。成纖維細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后篩選，獲得了同時(shí)具有G418抗性與表達(dá)紅色熒光蛋白的細(xì)胞克隆，外源目的基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到細(xì)胞基因組中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系與非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的各個(gè)時(shí)期特征基本保持一致，兩種細(xì)胞系的染色體數(shù)目正常(2n=60)比率分別為76．7％(23／30)和83．3％(25／30)，兩種細(xì)胞的染色體數(shù)目正常率相近。上述分析表明獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞完全可用于下一步體細(xì)胞核移植。3．利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因絨山羊胚胎
5、以屠宰場(chǎng)絨山羊卵巢為材料，采用切割法收集卵母細(xì)胞，并進(jìn)行體外成熟，成熟的卵母細(xì)胞通過顯微操作的方法去除核物質(zhì)并注入轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞，隨后利用電擊的方法將二者進(jìn)行融合形成重構(gòu)胚胎，重構(gòu)胚胎經(jīng)體外激活后體外2金永毛囊細(xì)胞特異表達(dá)胸腺素B4基因轉(zhuǎn)基因絨山羊研究發(fā)育到4．8細(xì)胞階段進(jìn)行胚胎移植。絨山羊卵母細(xì)胞體外成熟率為77．5％，去核存活率為93．6％，重構(gòu)胚胎的融合率為82．4％，體外發(fā)育卵裂率為93．5％，8．細(xì)胞率為24．5％，囊胚率為14．3％。PCR鑒定結(jié)果表明，外源基因穩(wěn)定整合于轉(zhuǎn)基因胚胎基因組，熒光
6、顯微鏡觀察紅色熒光蛋白在轉(zhuǎn)基因胚胎中穩(wěn)定表達(dá)。為探究絨山羊的體細(xì)胞核移植過程中高效的體外激活方法，利用IA23187+6一DMAP，Ionomycin+6一DMAP，7％乙醇+6一DMAP，IA23187+CHX，Ionomycin+CHX，7％乙醇+CHX處理體外成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外激活研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IA23187+6．DMAP和Ionomycin+6一DMAP處理卵母細(xì)胞可獲得較高的囊胚率，兩種方法均為激活絨山羊卵母細(xì)胞最適方法。4．轉(zhuǎn)基因絨山羊的生產(chǎn)與PCR鑒定利用轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)
7、的轉(zhuǎn)基因胚胎，進(jìn)行受體山羊的胚胎移植，經(jīng)過情期觀察確定妊娠母羊數(shù)量并進(jìn)行母羊的孕期飼養(yǎng)管理，最終獲得19只轉(zhuǎn)基因絨山羊。轉(zhuǎn)基因絨山羊經(jīng)過血樣的提取及PCR鑒定，證明19只羔羊均為轉(zhuǎn)pCDsR_KT基因絨山羊，其中從15R羔羊的基因組中檢測(cè)到了胸腺素肛基因；而其他4X羔羊的基因組中整合有pCDsR-KT載體的部分序列，3只羔羊的基因組中整合有新霉素抗性基因，全部4只羔羊的基因組中都整合有CMV啟動(dòng)子序列。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因絨山羊，毛囊細(xì)胞特異表達(dá)，胸腺素肛，胎兒成纖維細(xì)胞，體細(xì)胞核移植，PCR鑒定，內(nèi)蒙古大學(xué)
8、碩士學(xué)位論文TRANSGENICCASHMEREGOATOFHAIRFOLLICLECELLSSPECIFICEXPRESSIONTI
9、YMOSINBETA4ABSTRACTTransgenieanimaltechnology，basedoncytogenetics，moleculargenetics，embryonicdevelopmentandrecombinantDNAtechnology，isoneofmostrapiddevelo
