富硒靈芝中水溶性硒蛋白純化表征及其生物活性的研究

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1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要捅要本論文以富硒靈芝子實(shí)體為原料，比較了四種蛋白提取物(水溶、鹽溶、醇溶、堿溶)的氨基酸組成、蛋白質(zhì)分布、糖含量、硒含量及自由基清除活性的差異。結(jié)果表明：水溶性、鹽溶性和堿溶性粗蛋白的氨基酸整體分布不存在差異，而醇溶性粗蛋白同其它三者間存在較大差異。水溶性粗蛋白具有最高的硒含量、最多的蛋白種類及最為寬泛的分子量范圍、最強(qiáng)的自由基清除活性，堿溶性蛋白則具有最少的糖含量。自由基清除活性從低到高的順序?yàn)椋捍既?鹽溶<堿溶<水溶。每種粗蛋白對自由基的清除率與蛋白濃度之間的關(guān)系可用對數(shù)方

2、程表示，它們的硒含量趨勢與抗氧化性趨勢間具有較好的一致性，蛋白分布和氨基酸組成等也是影響抗氧化性的重要因素，并且它們之問不存在抗氧化協(xié)同作用，因此選定富硒靈芝水溶性硒蛋白作為進(jìn)一步研究的對象。以蛋白質(zhì)結(jié)合的硒量和自由基清除活性為指標(biāo)，依次采用硫酸銨沉淀、離子交換樹脂層析、分子排阻層析等方法對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果表明：選擇80％作為沉淀蛋白質(zhì)的硫酸銨飽和度，得到粗蛋白的硒含量是1．884mg／g，純化產(chǎn)率為12．63％；經(jīng)過QSepharoseFastFlow強(qiáng)陰離子交換樹脂初步純化的蛋白的硒含量是2．835

3、mg／g，純化產(chǎn)率為1．476％，純化倍數(shù)為118．1倍：經(jīng)過SephadexG．100葡聚糖凝膠進(jìn)一步純化的蛋白命名為Se-GL．P，硒含量是4．87mgCg。純化產(chǎn)率為0．8941％，純化倍數(shù)為203．7倍，此蛋白達(dá)到電泳純度，并顯示出一定的抗氧化活性。硒蛋白的抗氧化活性隨著蛋白質(zhì)結(jié)臺的硒量增加而增強(qiáng)，顯示了富硒靈芝硒蛋白在發(fā)揮抗氧化作用過程中硒與蛋白間的協(xié)同作用。對該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步表征的結(jié)果表明：Se—GL-P是一種硒蛋白，其中31．275％的se是以硒代半胱氨酸形式存在的，68．725％的se是

4、以硒代蛋氨酸形式存在。Se-GL．P是具有一個亞基的蛋白，分子量是36，600Da，等電點(diǎn)是4．ol，糖含量為19．8％，硒含量是4．87mg／g，N．末端的氨基酸序列為D1NGGGATLPQKLYLTPDVL。Se．GL．P是一種新蛋白質(zhì)，屬于DING蛋白家族中的一員。Se，GL，P體外抗氧化活性、免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性的研究結(jié)果表明：Se-GL．P具有很強(qiáng)的羥自由基(rio·)和超氧自由基(02-·)清除活性，清除率與Se43L-P之間存在劑量依賴關(guān)系，表現(xiàn)為對數(shù)回歸關(guān)系；在相同的蛋白濃度下，Se-GL

5、．P的02一·清除率高于對HO·的清除活性。純化得到的Se．GL．P的抗氧化活性約高于未經(jīng)純化的粗蛋白3倍。Se．GL．P的低中高劑量組均具有一定的促T、B淋巴細(xì)胞增殖活性，對小鼠NK細(xì)胞殺傷活性也具有很大促進(jìn)作用。然而，Se-GL．P卻不能刺激小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)生更多的免疫因子TNF．n。樣品免疫調(diào)節(jié)活性由弱到強(qiáng)的順序?yàn)椋篘a2Se03=BSA+Na2Se03

6、腫瘤活性，在100¨g／mL濃度下，具有抑制HL-60人白血病細(xì)胞、BGC．823人胃癌細(xì)胞、Bel．7402人肝癌細(xì)胞和KB人鼻咽癌細(xì)胞增殖活性，抑制率分別達(dá)到46．5％、46．3％、45．58％平¨4355％。從本文的結(jié)果可以看出，寓硒靈芝硒蛋白具有較高的生物學(xué)活性，所以寓硒靈芝蛋白可作為一種新的高生物活性成分進(jìn)一步深入研究平lI推J’應(yīng)用。關(guān)鍵詞：富硒靈芝子實(shí)體．硒蛋白，純化，性質(zhì)表征，生物活性ABSTRACTThehymenophoreofSe-enrichedGanodermaLucidum(Se-

7、GL)wastheexperimentalmaterialinthispaper．Thedifferenceamongaminoacidcompositions，thedistributionofproteins，thecontentofsugar,thecontentofSelenium，andthescavengingactivityonradicalsoffourkindsofcrudeproteinsweredetermined．Thefourkindsofproeinswerewatersolubl

8、ecrudeprotein(SeGLPr(H20))，saltsolublecrudeprotein(SeGLPr(NaCI))，ethanolsolublecrudeprotein(SeGLPr(EtOH))andalkalisolublecrudeprotein(SeGLPr(NaOH))．Resultsshowedthatnosignificantdifferencebetweentheami