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《家蠶凋亡相關(guān)基因bmicad的表達(dá)及其功能研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要ICAD(DFp鈣)基因在細(xì)胞凋亡過程具有重要的作用。在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中，DFF(DNAfragmentationfactor)引起DNA的斷裂是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵步驟，DFF由蛋白復(fù)合體ICAD／DFF-45和CAD／DFF一40組成。ICAD不僅可以抑制CAD的DNase活性，還具有分子伴侶作用。當(dāng)細(xì)胞凋亡信號(hào)激活，效應(yīng)酶Caspase3被激活開始裂解ICAD，釋放CAD進(jìn)入細(xì)胞核從而引起DNA裂解和核濃縮。為了研究ICAD在家蠶細(xì)胞凋亡過程中的作用，本研究通過提取家蠶五齡幼蟲組織的總RNA，利用RT．PCR的方
2、法獲得了BmlCAD基因的cDNA序列，該eDNA序列全長(zhǎng)844bp，含有一個(gè)522bp的ORF，編碼174個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量為19．6kD，等電點(diǎn)為4．23。將BmlCAD基因片段克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，得到重組質(zhì)粒pET-28a(+)．BmlCAD，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測(cè)序分析證實(shí)重組質(zhì)粒正確。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E．coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)(25℃)表達(dá)后，裂解茵體作SDS．PAGE分析，與陰性對(duì)照相比在25kD(融合標(biāo)簽為3．84kD)附近有一條特異性蛋白條帶，與預(yù)測(cè)值相
3、符。重組蛋白主要以上清溶解的形式存在，利用親和層析的方法純化重組融合蛋白。將純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，ELISA檢測(cè)該抗體血清的效價(jià)可達(dá)到1：25600以上。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明BmlCAD在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞Bin5中主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。RNAi、MTT檢測(cè)和DNA片段化檢測(cè)結(jié)果表明BmlCAD基因被干擾后會(huì)顯著增加BmN細(xì)胞的凋亡比例。蛋白互作研究結(jié)果表明Bm／CAD與兩個(gè)蛋白因子——家蠶的DNA超螺旋因子(DNAsupercoilingfactor，SCF)和家蠶的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secretedproteinac
4、idicandrichincysteine，SPARC)相互作用。以上的研究結(jié)果表明，BmICAD具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，SCF和SPARC兩個(gè)蛋白因子可能通過與BmlCAD的相互作用分別在DNA斷裂和細(xì)胞凋亡這一過程中起重要作用。關(guān)鍵詞：家蠶；BIIlICAD；亞細(xì)胞定位；RN礎(chǔ)；蛋白互作浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文ExrandFunctionalAnalysisofBmlCADGenexoressionandUnctionnalyslsBmlCAGene0IRelatedtoApoptosisinSilkworm，BombyxmoriAbs
5、tractTheICAD(DFF-45)geneplaysallimportantroleintheprocessofapoptosis(programmedcelldeath)．CleavageofchromosomalDNAintonucleosomalmulfimerfragmentsisahallmarkofapoptosis，whichismediatedbytheDNAfragmentationfactor(DFF)complex．DFFisaheterodimericproteincomplexconsistingofa45k
6、D(DFF45／ICAD)anda40kD(DFF40／CPAN／CAD)subunit．ICAD／DFF45actsasaninhibitorforDFF40enzymaticactivityandchaperoneforCAD／DFF一40duringitssynthesis．ICADisacaspase一3substratethatmustbecleavedtobeinactivatedandallowCAD／DFF40toexecutenuclearintemucleosomalDNAfragmentation．BmlCADgene
7、WasobtainedfromthefifthinstarlarvaofBombyxmoribyRT—PCtLTheBmlCADeDNAWas844bpinlength，containinga522bpopenreadingframe(ORF)，whichencodedaproteinof174aminoacids；themolecularweightofthisproteinWasestimatedtobe19．6kDandtheisoelectricpointWas4．23．ThegenewasclonedintothepET-28a(
8、+)vector,andoverexpressedinE．coliBL21(DE3)asHis-taggedfusionproteins，inducedbyIPTGat25"C．
