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《sirt1基因?qū)ν俗冏甸g盤調(diào)控作用及其機(jī)制研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文7代髓核細(xì)胞分別行形態(tài)學(xué)觀察，SA．p．gal染色觀察細(xì)胞衰老及甲苯胺藍(lán)染色觀察蛋白多糖表達(dá)。取同為第1代細(xì)胞分別進(jìn)行單層培養(yǎng)和藻酸鹽立體培養(yǎng)，觀察其胞外基質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞增殖差異。結(jié)果：成功分離培養(yǎng)出原代髓核細(xì)胞，經(jīng)大體形態(tài)觀察，II型膠原和aggrecan細(xì)胞免疫熒光，HIF-10L細(xì)胞免疫組化及CD24流式細(xì)胞檢測綜合判定所培養(yǎng)的細(xì)胞為髓核細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀測及SA．p—gal、甲苯胺藍(lán)染色示，在體外連續(xù)單層培養(yǎng)條件下髓核細(xì)胞容易改變自身表型，發(fā)生去分化現(xiàn)象，且隨著傳代次數(shù)的增加趨
2、勢愈加明顯。藻酸鹽培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖速率低于單層培養(yǎng)，但胞外基質(zhì)collagenII和aggrecan表達(dá)顯著提高。結(jié)論：酶序貫消化法可以成功培養(yǎng)出髓核細(xì)胞，單層培養(yǎng)過程中容易使髓核細(xì)胞失去固有表型，而藻酸微球培養(yǎng)環(huán)境有利于髓核細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下維持表型，維持胞外基質(zhì)的表達(dá)，為進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)的檢測打下基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：髓核細(xì)胞，酶序貫消化法，單層培養(yǎng)，藻酸鹽培養(yǎng)第二部分白藜蘆醇對退變髓核細(xì)胞合成胞外基質(zhì)調(diào)控作用研究目的：研究SIRTl生物激動劑RES對人退變椎間盤髓核細(xì)胞合成ECM的影響。方法：取腰椎間盤突出癥患
3、者術(shù)中摘除的髓核組織，對其進(jìn)行分離、體外藻酸鹽三維培養(yǎng)，采用不同濃度RES(50pmol／L和10pmol／L)1重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文和sirtinol(10“mol／L和1肛nol／L)分別刺激，PCR檢測對SIRTl、II型膠原、aggrecan的mRNA表達(dá)。在10ng／mlIL-1B刺激下檢測501amol／LRES與101amol／Lsirtinol對相關(guān)代謝酶MMP-2、13，ADAMTS一5，TIMP一1的mRNA表達(dá)影響。結(jié)果：白藜蘆醇處理后，無論是RT-PCR還是qRT-PCR均顯
4、示SIRTl、II型膠原、aggrecan的mRNA表達(dá)水平增高，qRT-PCR示RES亦明顯抑制了IL一1p所誘導(dǎo)的MMP一2、13，ADAMTS-5的增高，TIMP-1的mRNA表達(dá)在與對照組的比較中顯著升高，sirtinol組觀測結(jié)果剛好相反。結(jié)論：RES可刺激退變髓核細(xì)胞ECM的合成，可以抑制IL-lD介導(dǎo)的對ECM的降解作用，這種調(diào)節(jié)作用與SIRTl的活性有關(guān)。關(guān)鍵詞：髓核細(xì)胞，白藜蘆醇，胞外基質(zhì)，SIRTl第三部分SIRTl基因?qū)υ缙谕俗兯韬思?xì)胞胞外基質(zhì)與細(xì)胞凋亡調(diào)控作用及其機(jī)制研究目的：研究SI
5、RTl對早期退變椎問盤髓核細(xì)胞ECM和細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。方法：取腰椎問盤突出癥患者手術(shù)來源的髓核組織，運(yùn)用磁共振，免疫組化，TUNEL染色，P53、P21蛋白測定以及甲苯胺藍(lán)染色等方式初步探討SIRTl與ECM和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。對年輕組的髓核細(xì)胞行體外藻酸鹽三維培養(yǎng)，運(yùn)用SIRTl．siRNA和慢病毒介導(dǎo)的SIRTld重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞，靶向調(diào)控SIRTl的沉默和過表達(dá)，檢測其對ECM合成影響，加入10ng／mlIL一113刺激后，westernblot，DMMB法，流
6、式細(xì)胞儀檢測胞內(nèi)SIRTl受到靶向調(diào)控后對IL．1B誘導(dǎo)的胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡的影響。Westernblot檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后對P65和乙?；疨65蛋白表達(dá)的影響，免疫共沉淀檢測SIRTl與P65之間是否存在相互作用，細(xì)胞免疫熒光觀察SIRTl對P65核內(nèi)遷徙的影響。結(jié)果：老年組SIRTl的表達(dá)明顯低于年輕組，而細(xì)胞凋亡率和合成ECM的能力亦明顯低于年輕組。SIRTl表達(dá)被siRNA靶向沉默后，白藜蘆醇對ECM的促進(jìn)作用明顯減弱。慢病毒轉(zhuǎn)染成功后，SIRTl表達(dá)增高，酶的活性亦隨之增高，但westernblo
7、t檢測COL2A1和aggrecan的蛋白表達(dá)并沒有明顯差異，DMMB法測GAG表達(dá)與對照組相比也未見明顯差異。但SIRTl過表達(dá)后對IL．1p介導(dǎo)的ECM降解以及細(xì)胞凋亡具有明顯保護(hù)作用。SIRTl過表達(dá)后可以顯著抑制IL．1B誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，SIRTl．siRNA組的細(xì)胞凋亡率則明顯上升。SIRTl過表達(dá)后能降低乙酰化P65蛋白的表達(dá)水平，阻止IL．1B介導(dǎo)的P65向核內(nèi)遷徙，且免疫共沉淀示SIRTl與P65蛋白之間存在相互作用。結(jié)論：SIRTl在早期退變的髓核組織中存在著重要的調(diào)控作用，有望成為治療椎間
8、盤退行性疾病的潛在靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞：SIRTl，髓核細(xì)胞，胞外基質(zhì)，細(xì)胞凋亡，NF．rd3重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文THERoLEANDMECHANISMOFSIRTloNTHEDEGENERATIVElNTERVERTEBRALDISCABSTRACTIntervertebraldiscdegeneration(IVDD)isthepreconditionandpathologicalbasisf
