“勞倦過度、房事不節(jié)”腎陽虛模型小鼠免疫功能和精子發(fā)生改變的研究

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1、。勞倦過度．房事不節(jié)”腎陽虛模型小鼠免疫功能和精子發(fā)生改變的研究實驗研究一、材料與方法(一)實驗材料I．實驗動物：昆明種健康雄性小白鼠60只，體質(zhì)量30-409；雌鼠240只，體質(zhì)量25—309；由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。2．實驗藥品：戊酸雌二醇由法國Scherings．A公司生產(chǎn)，批號為037B-2。金匱腎氣丸由山東濟南市宏濟堂制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號為20050412，主要成分：干地黃、山茱荑、山藥、附子、澤瀉、茯苓、丹皮、桂枝。3．實驗試劑：IL一2試劑盒由北京美迪科生物技術(shù)有限公司提供，批號為20050617。Bcl一2試劑盒購自北京中山生物醫(yī)學(xué)工程有限公

2、司，批號為20051107。睪酮放射免疫試劑盒，購于北京中山生物醫(yī)學(xué)工程有限公司，批號為20051104。4．主要實驗儀器6MF型全自動Y一放射免疫計數(shù)器，江蘇省醫(yī)療電子研究所生產(chǎn)；DDL一5冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；POLYVAR萬能研究顯微鏡；電子天平(WTll001R)型，江蘇省常州市萬得天平儀器廠；石蠟切片機。(二)實驗方法1．動情期雌鼠的準(zhǔn)備及雄鼠的篩選(I)動情期雌鼠的準(zhǔn)備：雌鼠每天灌胃戊酸雌二醇混懸液0．Iml／lOg(含藥0．0013mg)，以陰道涂片檢查角化細胞證實此鼠處于動情期嘲。(2)雄鼠的篩選：將每只雄鼠與兩只動情期雌鼠共籠，次日取出雌鼠有

3、陰道拴籠中的雄鼠為實驗用雄鼠。2．實驗動物分組、造模及給藥實驗用雄鼠60只隨機分為3組，每組20只。(1)對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，每天灌胃蒸餾水0．Iml／lOg。(2)“勞倦過度、房事不節(jié)”腎陽虛模型組(簡稱模型組)：每天8：00在水深25cm、水溫2522、容積5000ml的圓形玻璃缸內(nèi)強迫小鼠游泳至無力而下沉?xí)r撈出，山東中醫(yī)藥大學(xué)2007屆碩士擘位論文以造成勞倦過度。每只雄鼠與6只動情期蟾鼠同籠，每天更換動情期雌鼠以誘導(dǎo)房事不帶，每天灌霉蒸餒水0。Iml／lOg，共實驗4周。(3)金匱腎氣丸治療綴；造模方法同模型組，根據(jù)小鼠不同體質(zhì)量每天灌胃舉囂含藥量豹鑫匿‘霉曳丸混惹渡0

4、。Iml／lOg(會蘩0。02349)。共實驗4周，第2、4周末每組隨機處死lO只小鼠，即每批每組lO只，每批接鞠炎。金囂鬻氣丸混基滾醚潮方法：正常入耀量：一天2次，一次l兔(99／丸)，入與209小鼠比例為l：0．0026，小鼠每千克體熏用量為；99X2X0．0026×1000／20=2．349。3，指據(jù)檢測及方法(1)胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的測定：小鼠處死前電子天平稱其體質(zhì)量，處死后，娩瑟取莢建艨秘薅，叟理登拳凈洗，吸去表瑟渡體，瞧予天平豫重。謗葵鼴藤器數(shù)和薅指數(shù)。瓣藤捂數(shù)：璃藤指數(shù)=瓣豫重／體重脾指數(shù)：脾指數(shù)=脾臟重／體重(2)IL一2的稔瀾：小鼠稱重稀，戊巴比妥麻醉，解割

5、，鹱主靜脈取瓶，離心，取瓶清，按IL_2放免試劑盒說明書操作。(3)瓶清睪酮測定：下腔靜脈取血，5％EDTA抗凝，4"C條件下，以3000轉(zhuǎn)／分離心lO分鋒，分離瞧濤。羧放射免疫分攝試裁盒驄要求濺定睪舔戇含量。(4)肇丸組織形態(tài)學(xué)觀察采珥髓染色：三縫雄簸聰臻鯰死螽，輜離輦兔，霉予中毪福爾罵揀串羲定，敬材梯度酒精脫水，=甲苯透明，56-58℃浸蠟，包埋、常規(guī)切片，厚度為5urn，展片，干凈玻片撈片，60℃烘烤l小時后，二甲苯脫蠟5-10分鐘(×2次)，經(jīng)無永乙醇l一3分鐘(×2次)、95％7,醇I-3分鐘(x2次)、80％乙醇1分鐘(×2次)由贏到低梯度酒精水化后，蒸餾水水洗

6、，蘇木綮精染液5—10分鐘，蒸餾水水洗后，1％鹽酸乙醇分化l一3秒，l％氨水洗返蘸，滾水諍洗居，0。5％伊絞潦色l峭分鋒，蒸镩本承洗經(jīng)湊80％乙醇卜2分鐘(×2次)、95％乙醇2q分鐘(×2次)、無水乙醇3—5分鐘(×2次)賚低到蓬攆疫滔穗殘承蓐，石炭酸與二譯苯透鹱≯5分鎊，孛經(jīng)拷荻瓣背。(5)肇丸組織中Bcl一2蛋白的寢達采耀免疫組織純學(xué)染色4“勞僖髓廑、辛事蒜節(jié)”霧輯虞模型小鼠免疫動能和糖子發(fā)生改變的磺霓①睪丸稱麓后，立刻用4％多聚甲醮固定I小時。②玻冀溺多蒙羧氯羧楚理。常瓣魏零、浚蟥、纛蠼，輳背簿度6um。③常規(guī)脫蠟至水。30％H。Od份+蒸餾水10份混合，室溫10分

7、鐘，以滅活內(nèi)源憔酶，蒸鎊零洗3次。④切片上滴加3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶。37"C消化20分鐘，PBS洗3次X5勢鋒，蒸餾永浚1次。⑤艋匿定：用1％多漿甲醛嶷溫嬲定lO分鐘，蒸餾水洗滌3次。⑥颥雜交：千的雜交盒底部加2096曾油20ml以保持濕度。按每張切片20ul加預(yù)雜交液，毽灄瓣4e℃，3，l、封，暖載多余渡體，零浚。雜交：褥張切片20ul凝交液，加在切片上，將原位雜交專用載玻片的保護膜搦好鬟，墓在鏹麓士，毽澄籍38-42℃雜交蓬寢。雜交后洗滌：揭開盞玻片，37℃水溫的2Xssc洗滌5分鐘×2次，37℃水溫的