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《草莓冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子cbf的克隆與結(jié)構(gòu)分析及其抗寒特性研究》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文草莓冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF的克隆與結(jié)構(gòu)分析及其抗寒特性研究姓名:張勇申請學(xué)位級別:博士專業(yè):果樹學(xué)指導(dǎo)教師:湯浩茹20090601四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文捅要草莓是目前果樹保護(hù)地生產(chǎn)中種植面積最大的一個(gè)樹種,由于南方冬季溫度較高,草莓的越冬保護(hù)措施不嚴(yán)格,再加上溫室的低溫逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象,草莓在栽培過程中往往會受到偶發(fā)性的短時(shí)低溫傷害,從而給草莓生產(chǎn)帶來巨大損失。利用基因組學(xué)和分子生物學(xué)如克隆、基因操作、遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)可以克服傳統(tǒng)育種手段的不足,可以為研究草莓耐寒機(jī)制和抗寒育種提供新的思路和方法。CBF(CRT/DREbindingfactor,CBF)是一類與低
2、溫脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,它能夠特異地結(jié)合到含有CRT/DRE元件的COR基因啟動子區(qū),從而激活COR基因的表達(dá)進(jìn)而提高植物的抗寒性。因此,CBF類轉(zhuǎn)錄因子能夠綜合地改良植物的抗寒性狀,是目前比較理想的植物抗逆工程基因。本試驗(yàn)以草莓栽培品種‘豐香’(FragariaXananassacv.Toyonaka)為試材,通過與GenBank上發(fā)表的幾種植物ai琺因進(jìn)行同源比較,根據(jù)氨基酸序列保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物,采用熱啟動降落PCR方法擴(kuò)增得到草莓轉(zhuǎn)錄因子Facbfl基因的中間片段。在此基礎(chǔ)上,通過SON-PCR和RT.PCR,從草莓中分離克隆了Facbfl基因編碼區(qū)全長cDNA序列,Ge
3、nBank登錄號為FJ767754。該片段長794bp,包含一個(gè)長為636bp的完整ORF,編碼1個(gè)由211個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),預(yù)測分子量為23.4kDa,等電點(diǎn)為6.53。氨基酸序列分析表明FaCBFl蛋白含有一個(gè)保守的AP2結(jié)合域,在AP2結(jié)合域的兩端含有兩段保守的短多肽序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWRL。利用半定量RT.PCR對Facbfl基因進(jìn)行差異表達(dá)研究,結(jié)果表明Facbfl屬于冷誘導(dǎo)差異表達(dá)基因。未經(jīng)冷誘導(dǎo)處理的草莓幼葉內(nèi)Facbfl基因不表達(dá);經(jīng)冷處理后,F(xiàn)acbfl在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平迅速增加,在12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰并可以維持至iJ2
4、4h,而在冷脅迫的后期其表達(dá)水平開始下降。分析FaCBFl蛋白的理化特性,結(jié)果表明FaCBFl屬易溶、親水性強(qiáng)的蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明FaCBFl蛋白屬于CBF基因家族,與同屬植物具有比較近的進(jìn)化關(guān)系。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示,F(xiàn)aCBFl蛋白主要以Q.螺旋和無規(guī)則卷曲兩種形式出現(xiàn)。采用EsyPred3D同源模構(gòu)建的三維模型顯示,F(xiàn)aCBFl蛋白三維結(jié)構(gòu)在N端形成一個(gè)Q.螺旋,c端形成3個(gè)B.折疊,并與GCC-box結(jié)合蛋白有著結(jié)構(gòu)上的相似性。采用四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對FaCBFl的功能進(jìn)行了預(yù)測,結(jié)果表明FaCBFl屬于CBF家族的一員,含有保守的AP2結(jié)合域,具
5、有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和O.糖基化位點(diǎn),不含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。另外,對CBF的電子表達(dá)譜分析表明,CBF在植物中幾乎整株表達(dá),而且在多種組織和不同發(fā)育階段均能表達(dá),這也充分說明了CBF在植物生長發(fā)育中具有重要地位。冷馴化在輕至中等的低溫脅迫時(shí)有效,如果溫度過低或時(shí)間過長還會導(dǎo)致植物死亡。草莓幼苗經(jīng)O℃低溫鍛煉后,各種生理指標(biāo)的測試表明,草莓幼苗對低溫環(huán)境具有一定的冷適應(yīng)能力,即在一定程度上提高了植株的抗寒性。因此,適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚砜梢栽谝欢ǔ潭壬险T導(dǎo)草莓抗寒力的提高。這可能是外界溫度下降時(shí),植物感受低溫信號,并傳遞低溫信號到核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子CBF,進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或引起一系列生理生化反
6、應(yīng),如保護(hù)酶(SOD、CAT、APx和GR等)活性提高,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖)含量增加以及光合色素(葉綠素和類胡蘿卜素)含量下降,并且草莓Facbfl基因的表達(dá)與這些物質(zhì)的變化密切相關(guān)。由此可認(rèn)為植物在低溫鍛煉過程中往往會發(fā)生生理和代謝上的改變從而適應(yīng)低溫,是一個(gè)活躍的生理生化過程,植物抗寒力的提高是低溫誘導(dǎo)所引起的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CBF表達(dá)水平以及一系列細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各種生理生化代謝適應(yīng)性變化的綜合結(jié)果。上述研究對于填補(bǔ)園藝植物抗寒性生理及分子生物學(xué)研究具有重要的理論意義,并可對今后其他農(nóng)作物及園藝植物抗寒性的遺傳改良奠定了重要的基礎(chǔ),具有一定的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)
7、實(shí)意義。關(guān)鍵詞:草莓;冷誘導(dǎo);CBF;基因克??;結(jié)構(gòu)分析;抗寒特性Ⅱ四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文AbstractStrawberryproductionisthebiggestplantingareaatpresent.Thetemperatureiswarminsouth,theoverwinteringsafeguardofstrawberryisnotSeVereandthelowtemperaturereversionphenomenaoccurredSOthatstrawberrywo