草莓冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子cbf的克隆與結(jié)構(gòu)分析及其抗寒特性研究

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1、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文草莓冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF的克隆與結(jié)構(gòu)分析及其抗寒特性研究姓名：張勇申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：果樹學(xué)指導(dǎo)教師：湯浩茹20090601四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文捅要草莓是目前果樹保護(hù)地生產(chǎn)中種植面積最大的一個(gè)樹種，由于南方冬季溫度較高，草莓的越冬保護(hù)措施不嚴(yán)格，再加上溫室的低溫逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，草莓在栽培過程中往往會受到偶發(fā)性的短時(shí)低溫傷害，從而給草莓生產(chǎn)帶來巨大損失。利用基因組學(xué)和分子生物學(xué)如克隆、基因操作、遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)可以克服傳統(tǒng)育種手段的不足，可以為研究草莓耐寒機(jī)制和抗寒育種提供新的思路和方法。CBF(CRT／DREbindingfactor，CBF)是一類與低

2、溫脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠特異地結(jié)合到含有CRT／DRE元件的COR基因啟動子區(qū)，從而激活COR基因的表達(dá)進(jìn)而提高植物的抗寒性。因此，CBF類轉(zhuǎn)錄因子能夠綜合地改良植物的抗寒性狀，是目前比較理想的植物抗逆工程基因。本試驗(yàn)以草莓栽培品種‘豐香’(FragariaXananassacv．Toyonaka)為試材，通過與GenBank上發(fā)表的幾種植物ai琺因進(jìn)行同源比較，根據(jù)氨基酸序列保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，采用熱啟動降落PCR方法擴(kuò)增得到草莓轉(zhuǎn)錄因子Facbfl基因的中間片段。在此基礎(chǔ)上，通過SON-PCR和RT．PCR，從草莓中分離克隆了Facbfl基因編碼區(qū)全長cDNA序列，Ge

3、nBank登錄號為FJ767754。該片段長794bp，包含一個(gè)長為636bp的完整ORF，編碼1個(gè)由211個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，預(yù)測分子量為23．4kDa，等電點(diǎn)為6．53。氨基酸序列分析表明FaCBFl蛋白含有一個(gè)保守的AP2結(jié)合域，在AP2結(jié)合域的兩端含有兩段保守的短多肽序列PKK／RPAGRxKFxETRHP和DSAWRL。利用半定量RT．PCR對Facbfl基因進(jìn)行差異表達(dá)研究，結(jié)果表明Facbfl屬于冷誘導(dǎo)差異表達(dá)基因。未經(jīng)冷誘導(dǎo)處理的草莓幼葉內(nèi)Facbfl基因不表達(dá)；經(jīng)冷處理后，F(xiàn)acbfl在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平迅速增加，在12h時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰并可以維持至iJ2

4、4h，而在冷脅迫的后期其表達(dá)水平開始下降。分析FaCBFl蛋白的理化特性，結(jié)果表明FaCBFl屬易溶、親水性強(qiáng)的蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明FaCBFl蛋白屬于CBF基因家族，與同屬植物具有比較近的進(jìn)化關(guān)系。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)aCBFl蛋白主要以Q．螺旋和無規(guī)則卷曲兩種形式出現(xiàn)。采用EsyPred3D同源模構(gòu)建的三維模型顯示，F(xiàn)aCBFl蛋白三維結(jié)構(gòu)在N端形成一個(gè)Q．螺旋，c端形成3個(gè)B．折疊，并與GCC-box結(jié)合蛋白有著結(jié)構(gòu)上的相似性。采用四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器對FaCBFl的功能進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果表明FaCBFl屬于CBF家族的一員，含有保守的AP2結(jié)合域，具

5、有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和O．糖基化位點(diǎn)，不含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。另外，對CBF的電子表達(dá)譜分析表明，CBF在植物中幾乎整株表達(dá)，而且在多種組織和不同發(fā)育階段均能表達(dá)，這也充分說明了CBF在植物生長發(fā)育中具有重要地位。冷馴化在輕至中等的低溫脅迫時(shí)有效，如果溫度過低或時(shí)間過長還會導(dǎo)致植物死亡。草莓幼苗經(jīng)O℃低溫鍛煉后，各種生理指標(biāo)的測試表明，草莓幼苗對低溫環(huán)境具有一定的冷適應(yīng)能力，即在一定程度上提高了植株的抗寒性。因此，適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚砜梢栽谝欢ǔ潭壬险T導(dǎo)草莓抗寒力的提高。這可能是外界溫度下降時(shí)，植物感受低溫信號，并傳遞低溫信號到核內(nèi)激活轉(zhuǎn)錄因子CBF，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或引起一系列生理生化反

6、應(yīng)，如保護(hù)酶(SOD、CAT、APx和GR等)活性提高，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖)含量增加以及光合色素(葉綠素和類胡蘿卜素)含量下降，并且草莓Facbfl基因的表達(dá)與這些物質(zhì)的變化密切相關(guān)。由此可認(rèn)為植物在低溫鍛煉過程中往往會發(fā)生生理和代謝上的改變從而適應(yīng)低溫，是一個(gè)活躍的生理生化過程，植物抗寒力的提高是低溫誘導(dǎo)所引起的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CBF表達(dá)水平以及一系列細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各種生理生化代謝適應(yīng)性變化的綜合結(jié)果。上述研究對于填補(bǔ)園藝植物抗寒性生理及分子生物學(xué)研究具有重要的理論意義，并可對今后其他農(nóng)作物及園藝植物抗寒性的遺傳改良奠定了重要的基礎(chǔ)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)

7、實(shí)意義。關(guān)鍵詞：草莓；冷誘導(dǎo)；CBF；基因克??；結(jié)構(gòu)分析；抗寒特性Ⅱ四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文AbstractStrawberryproductionisthebiggestplantingareaatpresent．Thetemperatureiswarminsouth,theoverwinteringsafeguardofstrawberryisnotSeVereandthelowtemperaturereversionphenomenaoccurredSOthatstrawberrywo