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《nrf2在實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中表達及萊菔硫烷保護作用機制研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、河北醫(yī)科大學碩士學位論文Nrf2在實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中表達及萊菔硫烷保護作用機制研究姓名：李茹申請學位級別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學指導教師：郭力201203中文摘要Nrf2在實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中表達及萊菔硫烷保護作用機制研究摘目的：多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥性脫髓鞘疾病，目前其發(fā)病機制尚未完全明確，近年來許多研究表明，外源性與內源性親電子物質所引起的氧化應激是多發(fā)性硬化腦損傷的重要機制之一。細胞內氧化物質具有氧化性，可導致細胞死亡，
2、因此細胞啟動抗氧化應激系統(tǒng)保護神經(jīng)元。Nuclearfactor-erythroid2relatedfactor2(Nrf2)為可與抗氧化反應元件(antioxidantresponseelement，ARE)結合的轉錄因子，其結合后可啟動內源性抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生多種抗氧化酶，從而抑制氧化應激所造成的損傷。萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是一種異硫氰酸鹽，以其前體蘿卜甙形式廣泛存在于十字花科植物中，多項研究證實，萊菔硫烷為Nrf2的重要激活劑，其可促進Nrf2核轉位，與ARE結合j誘導II相解
3、毒酶表達產(chǎn)生抗氧化作用。由此可以推測，激活Nrf2／ARE通路可對EAE產(chǎn)生保護作用。萊菔硫烷對EAE的保護作用尚未有研究證明，萊菔硫烷誘導Nrf2核轉位作用較強，副作用小，可透過血腦屏障，腹腔注射可被吸收，所以選擇SFN進行試驗，并與目前臨床常用藥物地塞米松(dexamethasone，DXM)比較以明確SFN是否具有保護作用及其強弱，以此證明SFN是否對MS有治療價值。本實驗成功建立了小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EA
4、E)模型，測定了不同時間點小鼠腦組織中Nrf2及丙二醛(MDA)的表達水平，應用萊菔硫烷與地塞米松干預，觀察萊菔硫烷與地塞米松對神經(jīng)功能缺損評分、Nrf2和MDA的表達的影響，探討Nrf2和MDA的表達規(guī)律與萊菔硫烷對EAE的保護作用。方法：1動物分組：將120只8．10周雌性C57BL／6小鼠，體重18．209，隨機分為正常對照組，EAE組，萊菔硫烷組(50mg／kg)與地塞米松組(O．07mg／kg)；每組30只，每組又隨機分為13天、20天、30天三個亞組，每個亞組10只小鼠。中文摘要2模型制備
5、：將抗原MOG35．55用生理鹽水稀釋成6mg／ml，并按1：l等體積加入完全弗氏佐劑(其中結核桿菌H37Ra終濃度為4mg／m1)混合，乳化后按每只0．1ml于小鼠脊柱兩側分四點皮下注射，免疫當天即第Oh及第48h腹腔注射O．5mlPTX(1400ng／只)。免疫當天記為0天，免疫在乙醚麻醉及充分固定下進行。SFN組與DXM組在免疫后第一天起分別給予相應劑量的藥物進行腹腔注射，藥物隔日注射一次直至動物處死為止，正常對照組及EAE組小鼠給予等量的生理鹽水隔日腹腔注射。分別在第13天，20天，30天將動
6、物處死，留取腦組織與腰膨大，用免疫組織化學方法測定Nrf2在蛋白水平的動態(tài)表達。用硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA的動態(tài)表達。3神經(jīng)功能評分：于動物免疫當日及免疫后每日上午8：oo時下午17：oo時對動物體重、活動狀況、精神狀態(tài)、皮毛光澤度進行觀察，并對動物進行神經(jīng)功能評分，Benson評分標準：O分：無任何臨床癥狀；1分：尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙；2分：雙后肢無力，被動翻身后可以恢復；3分：雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復，但給予刺激后可以挪動；4分：雙后肢癱瘓，前肢癱瘓或肌力減弱伴尿便失禁；
7、5分：瀕死狀態(tài)或死亡。癥狀介于兩者標準之間者以土O．5計。4腦組織Nrf2表達的測定：將實驗小鼠于免疫后第13天、20天、30天時麻醉后4％多聚甲醛固定，甲醛固定好后取腦組織，于4％多聚甲醛中保存24小時，石蠟包埋，組織切片，應用SP法進行免疫組化，光學顯微鏡下觀察陽性細胞，并計數(shù)。5腦組織丙二醛的測定：將實驗小鼠于免疫后第13天、20天、30天時麻醉后，立即斷頭在冰盤上快速取腦，剝除硬腦膜，去除小腦、腦干、額極及腦室周圍皮層，在0．-一4℃生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，準確稱重，按1：9加入冰
8、冷生理鹽水制成組織勻漿液，然后在冰浴中超聲400安培，5s／次，間隙lO秒反復3-．一5次，2000r／min，4。C離心15min．取上清，置于．70℃冰箱中保存待測。結果：卜l動物發(fā)病率觀察：EAE組、SFN組與DXM組小鼠發(fā)病率分別為：100％、33．33％、27．78％。EAE組小鼠的發(fā)病率高于SFN組與DXM組，差異有統(tǒng)計學意義(P
