芍藥苷對k562細(xì)胞增殖的抑制作用及其機制研究

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1、芍藥昔對K562細(xì)胞增殖的抑制作用及其機制研究辛春雷1李軍1王志效2(1山東省濟寧市第一人民醫(yī)院272100；2濟寧市中心血站272100)【中圖分類號】R285【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1672-5085(2012)46-0200-02【摘要】目的探討芍藥昔對K562細(xì)胞生長抑制作用及其對細(xì)胞周期的影響。方法釆用MTT法測定芍藥昔對K562細(xì)胞的體外抑制作用，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白bcl?2,流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期。結(jié)果芍藥昔對K562細(xì)胞有抑制作用，可下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2的表達(dá)，阻止細(xì)胞周期于G1/S期。結(jié)論芍藥昔可明顯抑制k562細(xì)胞牛

2、長，阻止細(xì)胞周期。【關(guān)鍵詞】芍藥昔K562細(xì)胞細(xì)胞周期bcl-2目前治療血液惡性腫瘤的現(xiàn)代治療技術(shù)在挽救患者牛命，延長牛存期等方面使患者獲益匪淺。但同樣放化療的毒副作用，干細(xì)胞移植后牛活質(zhì)量的降低,使病人不能走向社會，也是需要解決的問題。中醫(yī)藥是一大寶庫，許多中藥對人體機能具有雙向調(diào)節(jié)性，有多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點的生物學(xué)效應(yīng)。芍藥昔是從中藥白芍提取的物質(zhì)，近年研究芍藥昔(paeoniflorin)具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保肝、鎮(zhèn)靜等作用[1-3]o1材料與方法1.1實驗儀器與試劑酶標(biāo)儀；流式細(xì)胞儀；C02孵箱。芍藥昔；MTT；胎牛血清；DAB顯色試劑盒；細(xì)胞免疫

3、化學(xué)染色試劑盒SP-20002；bcl-2單抗。1.2細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)K562常規(guī)培養(yǎng)傳代細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37°C、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.3體外藥效學(xué)試驗一細(xì)胞活性檢測(MTT)取對數(shù)牛長期的K562細(xì)胞，傳代接種于96孔板，每孔180μl（l×105/孔），設(shè)置對照組（不加藥）、空白組（只有培養(yǎng)基，無細(xì)胞）和5種濃度藥物組（0.1、1>10、100、1000μg•ml-l）,共分7組，每組設(shè)3個平行孔。在°、12、24、36、48、72h六個吋間點，選擇492nm波長在

4、酶標(biāo)儀上測各孔OD值，按下式計算細(xì)胞抑制率:IR%=（A對照一A實驗）/A對照×100%o1.4免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測bcl-2表達(dá)用三個不同濃度的芍藥昔（10μg•ml-l>20μg•ml-l、40μg•ml-l）處理細(xì)胞24小時,收集細(xì)胞,離心洗滌，丙酮固定，空氣干燥；加3%過氧化氫去離子水處理標(biāo)本lOmin；加山羊血清工作液50µl封閉，孵育；加一抗，37°C孵育2?3h；加生物素標(biāo)記的第二抗體50µl,孵育10?15min；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液50&mi

5、cro;l,孵育10~15min；加DAB溶液50µl,顯色3?5min,顯微鏡下觀察；如必要蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化、1%氨水返藍(lán)；乙醇逐級脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。1.5芍藥卄對K562細(xì)胞周期的影響用兩個不同濃度的芍藥昔（10μg•ml?l、20μg•ml-l）處理細(xì)胞12小吋，將K562細(xì)胞用PBS洗滌，用20μg•ml-l的碘化丙卩定（PI）溶液10μl在低溫下染色20分鐘,立即FCM檢測。1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用統(tǒng)計軟件SAS6.12進行分析，數(shù)據(jù)以均值&plu

6、smn;標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本均數(shù)的比較用t檢驗。2結(jié)果2.1細(xì)胞活性檢測（MTT）芍藥昔在濃度為20μg•ml-l吋可出現(xiàn)細(xì)胞生長現(xiàn)象，口隨吋間的延長生長抑制越明顯，具有時效關(guān)系（圖1）。圖1芍藥背與K562細(xì)胞共同孵育不同吋間的細(xì)胞生長曲線2.2流式細(xì)胞儀檢測K562細(xì)胞周期芍藥昔作用K562細(xì)胞12小吋檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示阻止細(xì)胞周期于G1/S期(表1)。表1芍藥昔對K562細(xì)胞周期的影響分組濃度(ug•ml-l)Gl前期G0/G1期S期G2/M期對照組一2.6040.2327.2517.32藥物組105.8416.12*30.5

7、6*35.29*2022.5112.35*28.41**27.35*與對照組比較*P<0.01,**P<0.052.3芍藥昔對K562細(xì)胞bcl-2表達(dá)的影響K562細(xì)胞bcl?2呈強陽性表達(dá)。芍藥昔處理后bcl?2蛋白表達(dá)減弱；在一定濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加bcl-2表達(dá)逐漸減少，對照組與20μg•ml?：L組、40μg•ml-l組比較有顯著差異(見表2)。表2芍藥昔對K562細(xì)胞bcl-2表達(dá)的影響(-X±S)組別濃度(ug•ml-l)blc-2表達(dá)率(%)對照組一90.56&plusm

8、n;8.781086.70±3.45*