纖維素酶活力測(cè)定

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1、纖維素酶活力測(cè)定（3,5-二硝基水楊酸法）姓名：高超年級(jí)：13級(jí)生科三班學(xué)號(hào)：201300140020同組者：樊曉航一，實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?，學(xué)習(xí)掌握光度計(jì)的使用；2，學(xué)習(xí)用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定纖維素酶活力二，實(shí)驗(yàn)原理：1、3,5-二硝基水楊酸法測(cè)纖維素酶活力的原理纖維素酶水解纖維素，產(chǎn)生纖維素二糖、葡萄糖等還原糖，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙色的氨基化合物，利用比色法測(cè)定還原物生成量來(lái)表示酶的活力。2、3,5-二硝基水楊酸法測(cè)還原糖的原理還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸

2、則被還原成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在過(guò)量的NaOH堿性溶液中此化合物呈橘紅色，在540nm處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)還原糖的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可以測(cè)定樣品中還原糖的含量。三，實(shí)驗(yàn)器材：器材;比色管、水浴鍋、電爐、分光光度計(jì)、容量瓶100ml、燒杯、移液槍試劑:1、3,5-二硝基水楊酸試劑,2、0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)水溶液，溶解后成膠裝液，靜置過(guò)夜，使用前搖勻。3、酶液（10ug/ml）四，實(shí)驗(yàn)步驟：1，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在還原糖實(shí)驗(yàn)中已做曲線如下：2，.?空白管的測(cè)定:取1

3、ml酶液，沸水浴5分鐘，冷卻加3ml0.5%CMC，與樣品管同時(shí)放入50度水浴30分鐘。其它操作同樣品管。?3.?樣品的測(cè)定：取0.5%羧甲基纖維素鈉溶液3ml，酶液1ml分別加入到三只比色管中標(biāo)記為1，2，3，于50度水浴中糖化30分鐘，取出，立即于沸水浴中煮沸10分鐘使酶失活，得糖化液，冷卻加入3ml顯色液，再沸水浴10分鐘，冷卻后加水定容至25ml，混勻，550nm測(cè)OD值4，測(cè)得的實(shí)驗(yàn)值如下;空白管：01號(hào)管：0.4262號(hào)管：0.4033號(hào)管：0.402五，試驗(yàn)結(jié)果分析：由三組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可用0.40

4、3帶入計(jì)算得0.561mg/ml,所以在30分鐘內(nèi)生成的還原糖為14.022mg;酶活力計(jì)算公式為：（14.022×100）/30=46.74六，注意事項(xiàng)：1，在測(cè)定OD值過(guò)程中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)要用1號(hào)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（葡萄糖濃度為0）調(diào)零，測(cè)定樣品OD值時(shí)要用樣品空白液調(diào)零。從實(shí)驗(yàn)原理上看，這樣做的目的是：無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)液還是樣品液，都要去除葡萄糖外的其他各種成分的對(duì)OD值的影響。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線經(jīng)過(guò)坐標(biāo)原點(diǎn)。?2.?用移液管或移液槍加各試劑時(shí)，不能將移液管或移液槍頭混用。