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《糞腸球菌esp基因克隆、原核表達及其蛋白初步研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號——ICS學(xué)校代碼!Q!圣魚學(xué)號窒鰻旦鯉!盟蔞i萋～莖一3墓蒙葛民熬大學(xué)碩士學(xué)、．文糞腸球菌esp基因克隆、原核表達及其蛋白初步研究EnterococcusEaecalisEspGeneCloning，ProkaryoticExpressionandProteinCharacteristicsPreliminaryResearch申請人：董國軍學(xué)科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向：動物傳染病的分子流行病學(xué)和防制新方法研究學(xué)位類別：學(xué)術(shù)學(xué)位指導(dǎo)教師：高原教授論文提交日期：二O一二年五月摘要目的：構(gòu)建內(nèi)蒙古鵝源糞腸球菌分離菌株，表面蛋白esp基
2、因的原核表達載體，并在BL21大腸桿菌中表達。對所表達的目的蛋白的免疫原性和反應(yīng)原性以及其蛋白的初步應(yīng)用進行研究。方法：構(gòu)建分離菌株esp基因的原核表達載體，誘導(dǎo)并純化蛋白后對所純化的目的蛋白進行初步分析：對糞腸球菌分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)株的DNA總基因組進行提取。依據(jù)Genebank中公御的esp基因堿基序列，應(yīng)用Primer5．0引物設(shè)計軟件，設(shè)計一對esp基因特異性引物。經(jīng)PCR擴增分離菌株esp基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后膠回收并純化目的片斷。將目的片斷與pMDl8一TVector克隆載體進行連接，轉(zhuǎn)化入DHSo感受態(tài)細胞中，對pMDl8T
3、—esp重組質(zhì)粒進行PCR擴增，單、雙酶切，測序鑒定。構(gòu)建pET28a-esp重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細胞中。將pET28a—esp／BL21經(jīng)過IPTG最佳濃度誘導(dǎo)，通過蛋白電泳SOS—PAGE鑒定『F確后，用鎳柱純化，得到純化的Esp目的蛋白。將制備的糞腸球菌全菌體超聲裂解滅活菌苗和Esp目的蛋白分別免疫家兔，獲得全菌體和目的蛋白的抗血清，通過Western-Blot方法檢測目的蛋白的免疫原性和間接ELISA方法檢驗?zāi)康牡鞍椎姆磻?yīng)原性。結(jié)果：1．構(gòu)建的重組質(zhì)粒由單、雙酶切，PCR擴增和測序鑒定正確后，表明成功的克隆了糞腸球菌es
4、p基因的堿基序列，并且證明克隆片段閱讀框架正確，重組質(zhì)粒的克隆載體構(gòu)建成功。2．成功構(gòu)建pET28a—esp／BL21，在pET28a(+)系統(tǒng)中成功表達了Esp融合蛋白，獲得小量純化的Esp重組目的蛋白。經(jīng)Western—blot及間接ELISA方法，證實了重組蛋白的免疫原性及反應(yīng)原性。結(jié)論：1．實驗表明糞腸球菌esp堿基序列克隆成功，該堿基序列長498bp編碼166個氨基酸。2．在pET28a系統(tǒng)中成功表達了Esp融合蛋白并小量純化，為進一步研究其生物學(xué)活性及臨床診斷治療奠定相關(guān)的理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：糞腸球菌；Esp基因；克?。辉吮磉_
5、；間接ELISAEnterococcusFaecalisEspGeneCloning，ProkaryoticExpressionandProteinCharacteristicsPreliminaryResearchAbstractObjectiv：Toconstructprokaryoticexpressionvectorofespgene，expressitinEscherichiacoliBL21，andstudytheimmunocompetenceandapplication．Methods：’GenomicDNAwasextr
6、actedn．omfaecalis，epitopesites，hydrophilicityandantigenicindexparameterswerepredictedbyDNAStarProteanprogramaccordingtotherelevantnucleotidesequencefromGenBank，andapairofspecificprimerswasdesignedtoamplifytheepitopeofespgenebyPCR．Thefragmentwasclonedintothemultiplecloning
7、siteofpET-28(a)，formingtherecombinantprokaryoticexpressionvector(pET28一esp)，TherecombinantplasmidpET28a—espwastransformedintoE．coliBL21bycommonmethodandtheBL21／pET28一espwasinducedbyIsopropyl—P—D-thioglactoside(IPIG)toexpressfusionprotein，optimizetheexpressioncondition．The
8、ntheexpressedproteinsinE．coliBL21wereanalyzedwithSDS—PAGEelectrophoresis．Westernblottingwasperfo
