桔小實(shí)蠅抗熱脅迫反應(yīng)的機(jī)制研究

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1、西南大學(xué)博士學(xué)位論文桔小實(shí)蠅抗熱脅迫反應(yīng)的機(jī)制研究姓名：夾福先申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治指導(dǎo)教師：王進(jìn)軍20120602中文摘要置量量曼量昌量量量量量詈昌量詈詈魯詈量量詈詈量量量詈詈量量量量量量量量量魯量量皇■量曹量量量喜量量量量量量量量昌詈量皇鼉詈詈昌皇篁薯昌詈詈量曼桔小實(shí)蠅B口c拋ce7位如坶a脅隸屬于雙翅目Diptera，實(shí)蠅科蛐tidae，是一種重要的世界性害蟲(chóng)。該蟲(chóng)可為害46個(gè)科的250多種水果和蔬菜，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。桔小實(shí)蠅具有很強(qiáng)的擴(kuò)散性和環(huán)境適應(yīng)性，能進(jìn)行遠(yuǎn)距離擴(kuò)散并迅速占領(lǐng)入侵地。該蟲(chóng)原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，現(xiàn)己成為

2、中國(guó)南部、東南亞、印度次大陸和夏威夷群島危險(xiǎn)性果蔬害蟲(chóng)，這些地區(qū)的夏季高溫往往高于400c；隨著全球氣候變暖，桔小實(shí)蠅逐漸向高緯度地區(qū)擴(kuò)散，在中國(guó)湖北、江蘇等冬季溫度低于00C的地區(qū)也可完成越冬。桔小實(shí)蠅適宜發(fā)育的溫度范圍在15～340C之間，因此，夏季高溫和冬季低溫等極端溫度必將對(duì)桔小實(shí)蠅造成熱脅迫。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，桔小實(shí)蠅形成了一系列反應(yīng)機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)熱脅迫。熱激蛋白是細(xì)胞或生物體在受熱或其他因素刺激后，所產(chǎn)生的一類在生物進(jìn)化中最保守并由熱休克基因所編碼的伴隨細(xì)胞蛋白，與生物體的熱耐受性和抗逆性有重要的關(guān)系。熱脅迫帶來(lái)的氧化壓力使生物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)

3、，而抗氧化系統(tǒng)則可以清除氧自由基，緩解氧化壓力，修復(fù)脅迫損傷等。以雙向電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)為核心的蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為分離鑒定昆蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白質(zhì)創(chuàng)造了有利條件。差異蛋白質(zhì)組學(xué)的興起，更是為分離已知的熱脅迫應(yīng)激蛋白，以及去尋找那在抗熱脅迫響應(yīng)過(guò)程中起作用的未知蛋白提供了有利工具。本學(xué)位論文以桔小實(shí)蠅為研究對(duì)象，在全球氣候變暖的大環(huán)境下，瞄準(zhǔn)生物適應(yīng)熱脅迫這一國(guó)際研究熱點(diǎn)，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法分離并鑒定了熱脅迫下桔小實(shí)蠅的響應(yīng)蛋白；采用微量滴定酶標(biāo)板法測(cè)定了其體內(nèi)抗氧化酶活性的變化；利用ImPCR、RACE及卯CR等技術(shù)克隆并解析了桔小實(shí)蠅熱激蛋白基因和抗氧化酶基

4、因及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式，從不同角度闡明了桔小實(shí)蠅對(duì)熱脅迫的響應(yīng)機(jī)制。經(jīng)過(guò)近3年的研究，獲得以下主要結(jié)果：1．桔小實(shí)蠅在熱脅迫下的抗氧化反應(yīng)丙二醛(加A)是多元未飽和脂肪酸過(guò)氧化反應(yīng)的主要氧化產(chǎn)物，可以通過(guò)測(cè)定其含量來(lái)明確脂質(zhì)過(guò)氧化的水平(LPO)，因此№A己被作為氧化脅迫的一個(gè)生物標(biāo)識(shí)。高溫和低溫脅迫下桔小實(shí)蠅體內(nèi)的MDA含量都較對(duì)照270C顯著升高，說(shuō)明熱脅迫打破了桔小實(shí)蠅體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的平衡，誘導(dǎo)了體內(nèi)抗氧化酶活性增強(qiáng)。桔小實(shí)蠅遭受熱脅迫后，其體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活性顯著升高，催化體內(nèi)因氧化脅迫而產(chǎn)生的高濃度超氧陰離子(02。。)發(fā)生歧化反應(yīng)生

5、成過(guò)氧化氫(H202)。隨著溫度極端升高和降低，SOD活性升高，同時(shí)隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。過(guò)氧化氫酶(CAr)活性較270C顯著增強(qiáng)，西南大學(xué)博士學(xué)位論文暑詈曼曼量舅鼉詈曼曼量昌曹寡量曼量曼詈曼曼量量詈詈篁舅皇!!曼曼曼鼉暑詈置皇皇皇曼曼量罾舅罾舅篡量罾曹曼曼曼曼量邑量曼曼皇曼曼曼昌皇量曼曼皇曼曼分解過(guò)量的H202，生成對(duì)機(jī)體無(wú)害的H20和02，以降低體內(nèi)活性氧(ROS)的含量而緩解氧化壓力；隨著溫度極端升高和降低，CAT活性升高，同時(shí)隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CAT活性也呈現(xiàn)上升后又下降的變化趨勢(shì)。谷胱甘肽S．轉(zhuǎn)移酶(GST)的活性也發(fā)生了

6、顯著的變化，高溫脅迫下顯著升高，低溫脅迫下隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，GST活性下降后又快速上升并高于對(duì)照270C下的活性；GST活性升高，分解過(guò)多的脂類過(guò)氧化物，在桔小實(shí)蠅抗熱脅迫導(dǎo)致的氧化脅迫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。過(guò)氧化物酶(POD)和總抗氧化能力(T-AOC)以較高的活性值穩(wěn)定地發(fā)揮著抗氧化脅迫的作用。2．桔小實(shí)蠅在熱脅迫下的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究雙向電泳是一種對(duì)生物體內(nèi)復(fù)雜蛋白質(zhì)體系進(jìn)行高效分離的技術(shù)，分辨率高、重復(fù)性好和穩(wěn)定性強(qiáng)是其最基本的特征。蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量直接影響雙向電泳的分離效果和生物信息的完整性。本研究選擇桔小實(shí)蠅體內(nèi)的總蛋白進(jìn)行分析，建立了一套穩(wěn)

7、定、重復(fù)性好的雙向電泳技術(shù)體系，全面挖掘桔小實(shí)蠅響應(yīng)抗熱脅迫反應(yīng)的功能蛋白：通過(guò)在常規(guī)裂解液中引入2M硫脲提高了蛋白質(zhì)特別是疏水蛋白的溶解性；繼而利用蛋白質(zhì)純化試劑盒純化獲得了高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品；在膠條平衡緩沖液中增加了甘油和SDS的含量提高了平衡效果；PAGE凝膠經(jīng)質(zhì)譜兼容的銀染方法染色，最終獲得了高分辨率的雙向電泳圖譜。上述雙向電泳技術(shù)體系的建立為分離和鑒定桔小實(shí)蠅抗熱脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)桔小實(shí)蠅抗熱脅迫的響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究。將試蟲(chóng)在400C高溫和OoC低溫下脅迫3h后，提取總蛋白質(zhì)，使用1，H3～10、17cm的膠條和1

8、0％SDS．PAGE凝膠進(jìn)行雙向電泳。經(jīng)PDouestV8．0．1