smo sirna對(duì)裸鼠食管癌移植瘤細(xì)胞凋亡影響的研究

《smo sirna對(duì)裸鼠食管癌移植瘤細(xì)胞凋亡影響的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文SmosiRNA對(duì)裸鼠食管癌移植瘤細(xì)胞凋亡影響的研究姓名：張虎申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：張紅；陳奎生201205摘要SmosiRNA對(duì)裸鼠食管癌移植瘤細(xì)胞凋亡影響的研究碩士研究生：張虎導(dǎo)師：張紅教授陳奎生教授鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河南鄭州450052摘要在消化系統(tǒng)腫瘤中，食管癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，對(duì)人類(lèi)的健康和生命造成了極大的威脅。其具有發(fā)病率高及發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移和死亡率高等特點(diǎn)。目前臨床上用于食管癌治療的方法主要是外科手術(shù)治療、化療、放療以及綜合治療，盡管近年來(lái)各種治療方

2、法得以不斷改進(jìn)和完善，但食管癌患者的預(yù)后仍然較差，為提高食管癌的療效和改善患者的生存質(zhì)量，尋求一種新的治療方法是當(dāng)前食管癌治療的研究熱點(diǎn)。Smoothened(Smo)基因是由3772bp構(gòu)成的DNA序列，基因定位于染色體7q32．3。Smo蛋白是由Smo基因編碼的一條具有1024個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。Smo蛋白在Hedgehog(m)信號(hào)通路中充當(dāng)著信號(hào)轉(zhuǎn)換器的作用，它可以將來(lái)自細(xì)胞外的Hh信號(hào)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)可識(shí)別的特異性轉(zhuǎn)錄因子Glil信號(hào)，進(jìn)而作用于下游靶基因Ptch、Wm、Bmps等。當(dāng)細(xì)胞間質(zhì)中有Hh配體存在時(shí)，Smo蛋白擺脫了Ptch

3、受體的束縛，此時(shí)的Smo蛋白將向微管復(fù)合體上Fu和Cos2提供磷酸基團(tuán)促使Glil從復(fù)合體上脫離，此時(shí)的Gli蛋白轉(zhuǎn)化成催化劑形式并以全長(zhǎng)的形式進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄。Glil基因定位于染色體12q13．2．q13．3，其與Gli2、Gli3均有5個(gè)保守的鋅指結(jié)構(gòu)，鋅指間由組氨酸與半胱氨酸連接。Glil基因編碼的產(chǎn)物Glil蛋白是特異性轉(zhuǎn)錄因子，可將胞質(zhì)內(nèi)信號(hào)傳遞到細(xì)胞核，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄，Gli基因摘要家族與果蠅Ci基因是同源基因，它們編碼的蛋白質(zhì)在Hh信號(hào)通路中起到關(guān)鍵作用。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)指雙鏈RN

4、A(double．strandedRNA，dsRNA)在胞質(zhì)中Dicer酶(一種核酶)的作用下，以一種ATP依賴(lài)的方式逐步將外來(lái)的雙鏈RNA(dsRNA)切割成特定長(zhǎng)度的小干擾RNA(siRNA)，長(zhǎng)度一般為2Int．23nt，siRNA再與體內(nèi)的內(nèi)切酶、外切酶和解旋酶等共同組成可被RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA—inducedsilencingcomplex，PdSC)，然后RISC激活A(yù)TP酶依賴(lài)的siRNA解雙鏈過(guò)程。外源性、內(nèi)源性基因編碼的mRNA與激活后的RISC在同源區(qū)域特異性的結(jié)合，在RISC的核酸酶功能的作用下，對(duì)其mRNA與siR

5、NA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合部的3端和5端切割，切割位點(diǎn)間的mRNA迅速被降解?，F(xiàn)已證實(shí)Smo基因的高表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，如：胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和基底細(xì)胞癌等。近期本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究結(jié)果顯示，Smo、Gli蛋白及mRNA在食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)；Smo高表達(dá)與食管鱗癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；SmosiRNA可抑制食管鱗癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。可見(jiàn)Smo與食管癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究采用不同濃度SmosiRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細(xì)胞，篩選出對(duì)Smo表達(dá)抑制效應(yīng)最強(qiáng)的SmosiRNA序列、濃度和作用時(shí)間后，構(gòu)建裸鼠食管癌移植瘤模型，即將

6、濃度為250ng／}tl的SmosiRNA．1轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞72h后收集細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度為1x107／ml，以裸小鼠背部肩胛旁區(qū)作為注射點(diǎn)，分別皮下注射0．2ml。采用免疫組織化學(xué)及Westemblot技術(shù)檢測(cè)各組瘤組織中Smo及Glil蛋白的表達(dá)；采用組織原位雜交及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組瘤組織中Smo及GlilmRNA的表達(dá)；采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，采用透射電鏡對(duì)凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，為分子靶向治療食管癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。材料和方法1．人食管癌EC9706細(xì)胞株來(lái)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；Balb／c裸

7、鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。2．分組轉(zhuǎn)染：設(shè)24h、48h和72h三個(gè)轉(zhuǎn)染時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段均設(shè)150ng／I_tl、200ng／I-tl和250ng／I_tl三個(gè)轉(zhuǎn)染劑量，將特異性siRNA．1、siRAN．2及siRAN．3分Ⅱ摘要?jiǎng)e轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，結(jié)果顯示250ng／I_tl、siRNA．1和72h組抑制效應(yīng)最強(qiáng)，并將此組細(xì)胞構(gòu)建為裸鼠食管癌移植瘤實(shí)驗(yàn)組。3．裸鼠食管癌移植瘤模型構(gòu)建：將裸鼠分為3組，每組5只分別為：siRNA干擾組、無(wú)關(guān)序列組和空白對(duì)照組，以肩胛下為注射點(diǎn)，分組皮下注射各組細(xì)胞，構(gòu)建裸鼠食管癌移植瘤模型。4．采用

8、免疫組織化學(xué)及Westernblot方法檢測(cè)各組瘤組織Smo及Glil蛋白的表達(dá)情況。5．采用組織原位雜交及RT．PCR技