肝癌患者術野血中癌細胞的示蹤研究

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1、遵義醫(yī)學院碩士學位論文肝癌患者術野血中癌細胞的示蹤研究姓名：李玲申請學位級別：碩士專業(yè)：麻醉學指導教師：朱昭瓊20120411遵義醫(yī)學院碩士學位論文肝癌患者手術野出血中腫瘤細胞示蹤研究肝癌患者術野血中癌細胞的示蹤研究研究生李玲導師朱昭瓊摘要目的：檢測肝癌患者行手術治療時，術野出血中是否存在癌細胞；若存在，確定其數量并分析判定其功能特性。方法：本實驗為開放式研究。共納入85名實驗研究對象，其中行手術治療的肝癌患者45名，行手術治療的非腫瘤患者20名，健康志愿者20名。收集每名研究對象性別、年齡、體重，記錄肝癌患者腫瘤發(fā)生來源、腫瘤大小、病理類型、分化程度及非腫瘤患者的臨床

2、診斷。使用自體血液回收機對27名肝癌患者的術中出血予以洗滌、回收250ml(本研究用20ml，其余用于其它實驗。A組)，抽取18名肝癌患者切肝前和切肝后循環(huán)血各20ml(B1組、B2組)，抽取非腫瘤患者術中循環(huán)血20ml(C組)及20名健康志愿者循環(huán)血20ml(D組)，共103例血液樣本。(1)有核細胞分離：裂解紅細胞法富集含腫瘤細胞的有核細胞，用于流式細胞術檢測和細胞涂片后免疫熒光染色；密度梯度離心法無菌分離含腫瘤細胞的有核細胞用于細胞培養(yǎng)。(2)腫瘤細胞的抗體標記：流式細胞術使用熒光抗體CKl9和CDl33標記腫瘤細胞，免疫熒光法使用AEl／AE3和CDl33標記腫

3、瘤細胞，兩種方法中均使用熒光染料DAPI標記細胞核。(3)腫瘤細胞的識別與檢測：流式細胞術用于計數血液中不同分化能力的活癌細胞數量；免疫熒光法用于檢測癌細胞的分化能力及數量，即染色后在熒光顯微鏡下觀察細胞特性并計數陽性細胞數量；細胞培養(yǎng)法用于檢測癌細胞的克隆增殖性，即原代培養(yǎng)10．15天，培養(yǎng)過程中觀察細胞生長情況并計數貼壁細胞數及克隆株數量，培養(yǎng)結束后行免疫熒光檢測，確定貼壁細胞或細胞克隆株性質。結果：(11流式細胞儀實際檢測到的肝癌患者術野血中存在的的CKl9陽性、CDl33陽性、雙陽性的活細胞數量分別為4．1×106_11．4×106、2．3×106-6．1×10

4、0、O．3×106_4．3x106個(95％置信區(qū)間)。各組CKl9陽性的活細胞數比較，肝癌患者術野血多于肝癌患者切肝前及切肝后循環(huán)血(P<0．05)，肝癌患者切肝前循環(huán)血陽性細胞數量少于非腫瘤患者循環(huán)血(尸

5、較無差別。雙陽性活細胞數僅在非腫瘤患者循環(huán)血組與健康志愿者循環(huán)血組之間存在統計學差異(P<0．05)。不同肝癌來源、病理類型及分化程度的肝癌患者術野血中的各類陽性細胞數量比較差異均無統計學意義(P>0．05)。(2)免疫熒光法結果提示：肝癌患者術野血中存在的AEl／AE3陽性、CDl33陽性及雙陽性細胞，個數分別為O．7．3×107、0．1．35x108、0-1．92x108個(95％參考值范圍)。肝癌患者術野血雙陽性細胞個數明顯多于各組循環(huán)血中雙陽性細胞個數(P<0．05)。循環(huán)血液各組問陽性細胞數量比較，非腫瘤患者、健康志愿者與肝癌患者切肝后循環(huán)血的AEl／AE3陽

6、性細胞數量比較有統計學差異(PO．05)。A組中不同肝癌來源、病理類型及分化程度的樣本中的各類陽性細胞數量分別比較，差異均無統計學意義(P>O．05)。(3)各組樣本細胞培養(yǎng)均發(fā)現有克隆株形成。A組25例樣本中有克隆株生成者為14例(56％)，B1、B2、C、D各組(n：18，18，20，20)的克隆生成率分別為5．6％、16．7％、5％、5％。A組克隆生成率明顯高于其余各組，差異有統計學意義(尸<0．01)，而各組循環(huán)血組間克隆生成率比較無差異(尸>0．05)。A組中不同肝癌來源、肝癌病理類型及肝癌的分化程

7、度的樣本克隆生成率均無明顯差異(P>O．05)，但有克隆株生成的肝癌體積較無克隆生成的肝癌體積大(尸<0．01)。培養(yǎng)后免疫熒光檢測發(fā)現肝癌患者術野血培養(yǎng)有大量AEl／AE3和CDl33雙陽性克隆株，而各組循環(huán)血培養(yǎng)多為AEl／AE3、CDl33單陽性或雙陽性的單個核細胞。結論：肝癌患者術野血中存在有具有自我增殖復制能力的癌細胞，并且這些細胞大多來源于術中手術操作造成的實體肝癌組織的癌細胞散落。術野血中的癌細胞數量、活性與肝癌的病理類型及分化程度無關。關鍵詞：肝癌、手術野、血液、癌細胞TranckingStudyofCancerCells