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1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文Lin28/miR--107與胃癌細(xì)胞化療敏感性的關(guān)系及機(jī)制研究姓名：滕榮躍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：王林波20120529浙江大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要Lin28／miR-107與胃癌細(xì)胞化療敏感性的關(guān)系及機(jī)制研究浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)博士研究生‘滕榮躍導(dǎo)師王林波中文摘要背景：胃癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率在全世界排名第三【l】。我國(guó)是胃癌好發(fā)地區(qū)，其年患病率和死亡率均為世界平均水平的2倍多。胃癌患者單純根治術(shù)5年生存率僅為40％左右，即使采用擴(kuò)大根治術(shù)亦未能顯著提高患者
2、術(shù)后生存率，手術(shù)+化療為其最佳治療手段。盡管化療藥物多種多樣，聯(lián)合化療可增加其有效率，而且有新藥的不斷研發(fā)及應(yīng)用臨床，但是中晚期胃癌的5年生存率仍低于30％【2’31，其中很大部分是由于化療耐藥引起。因此關(guān)于胃癌耐藥的機(jī)制研究，對(duì)進(jìn)一步提高胃癌治療效果具有十分重大的意義。目前認(rèn)為與胃癌耐藥相關(guān)的機(jī)制包括：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性、癌基因p53突變及凋亡相關(guān)通路等等。而腫瘤干細(xì)胞具有活躍的DNA修復(fù)能力、高表達(dá)三磷酸腺苷結(jié)合金(ATPbindingcasstte，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體
3、、抗輻射、抗凋亡等特性。因此腫瘤干細(xì)胞也就可能擁有耐藥的特性。研究發(fā)現(xiàn)Lin28是腫瘤干細(xì)胞重要的表面分子標(biāo)記物，其具有能參與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的形成及維持腫瘤干細(xì)胞特性等重要功能。而在Lin28與腫瘤治療療效的研究方面，有研究顯示Lin28可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞放療耐受。但Lin28在胃癌中與化療療效有無關(guān)系，目前尚不明確。我們擬通過以下研究，闡明Lin28與胃癌化療耐藥之間的關(guān)系，并通過體外研究探索其可能的分子機(jī)制，以期更加了解胃癌化療耐藥，并找到其中可能逆轉(zhuǎn)耐藥的潛在靶點(diǎn)。Ⅱ浙江大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要方法和結(jié)果：1．Li
4、n28表達(dá)與胃癌新輔助化療后病理反應(yīng)的相關(guān)性分析2004年至2011年我科收治有化療前胃鏡標(biāo)本的新輔助化療胃癌患者共47例。將其分為兩組，化療療效病理評(píng)估有反應(yīng)組(0～50％腫瘤細(xì)胞殘留)和化療療效臨床評(píng)估無反應(yīng)組(，50％腫瘤細(xì)胞殘留)。病理有反應(yīng)率為61．7％(29例)，38．3％(18例)患者化療對(duì)化療無反應(yīng)?？ǚ綑z驗(yàn)分析結(jié)果顯示Lin28表達(dá)水平和新輔助化療后病理反應(yīng)(0～50％腫瘤細(xì)胞殘留VS．，50％腫瘤細(xì)胞殘留)具有相關(guān)(P=O．002)，Lin28表達(dá)高的病例的病理反應(yīng)率低，腫瘤細(xì)胞殘留多。結(jié)果提示，
5、術(shù)前胃鏡Lin28高表達(dá)的患者對(duì)化療反應(yīng)性較差，Lin28可以作為預(yù)測(cè)胃癌化療反應(yīng)性的指標(biāo)。值得體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。2．穩(wěn)定表達(dá)Lin28胃癌細(xì)胞的構(gòu)建以及Lin28與胃癌細(xì)胞化療敏感性關(guān)系體外研究和機(jī)制探索在胃癌細(xì)胞(MKN28、MKN45、SGC7901、BGC823、AGS、N87)中，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)Lin28蛋白水平的表達(dá)量，結(jié)果提示Lin28在六株胃癌細(xì)胞中均沒有表達(dá)．挑選Lin28蛋白表達(dá)陰性胃癌細(xì)胞MKN28、MKN45穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3．1+-Lin28以及對(duì)照空質(zhì)粒pcDN
6、A3．1+，轉(zhuǎn)染后兩株細(xì)胞分別標(biāo)記為MKN45／Lin28、MKN45／Vector和MKN28／Lin28、MKN28／Vector。用MTT法比較轉(zhuǎn)染后兩株胃癌細(xì)胞株對(duì)四種化療藥物OXA，PTX，ADM，5．Fu的化療敏感性變化，并用流式細(xì)胞雙染技術(shù)比較在藥物作用后細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染lin28后胃癌細(xì)胞株MKN45及MKN28對(duì)OXA，PTX，ADM和5．Fu四種藥物的化療敏感性都降低，凋亡減少。通過siRNA干擾技術(shù)敲低Lin28穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的Lin28表達(dá)，用MTT及流式凋亡檢測(cè)的方法發(fā)現(xiàn)能增加Lin
7、28陽性胃癌細(xì)胞的化療敏感性，增加凋亡。用qPCR及WesternBlot技術(shù)，檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)Lin28的胃癌細(xì)胞株在耐藥基因及耐藥蛋白表達(dá)上的變化。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Lin28后可引起C．myo，MDRl／P．gP基因及蛋白的表達(dá)增加，周期蛋白CyclinDl表達(dá)減少；并且可致Caspase9及Caspase3浙江大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要的表達(dá)減少。檢測(cè)siRNA干擾后Lin28陽性細(xì)胞株在mRNA及蛋白水平表達(dá)顯示：敲低Lin28后可致C—mye，MDRl／P．gP的表達(dá)減少，CyclinDl表達(dá)增加。我們推測(cè)Lin28
8、引起化療敏感性變化的機(jī)制可能通過使胃癌細(xì)胞過表達(dá)C—mye，MDRl／P-gP，低表達(dá)CyclinDl有關(guān)。3．miR-107與Lin28基因之問的關(guān)系，Lin28／miRl07通路在胃癌細(xì)胞化療敏感性變化中起的作用及其機(jī)制研究．為研究Lin28能否通過miR．107對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控，檢測(cè)Lin28穩(wěn)定表達(dá)胃癌細(xì)胞株MKN45／Lin28及MK
