四溴雙酚a(tbbpa)對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)與差異基因篩選的研究

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1、中國海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文四溴雙酚A(TBBPA）對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)與差異基因篩選的研究姓名：宮曉莉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：水生生物學(xué)指導(dǎo)教師：潘魯青201206四溴雙酚A(TBBl，A)對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)與差異基因篩選的研究四溴雙酚A(T阻PA)對櫛孔扇貝毒性效應(yīng)與差異基因篩選的研究摘要為了防止火災(zāi)的發(fā)生，溴系阻燃劑(Brominatedn鋤eretardallts)被廣泛的應(yīng)用于塑料、電子產(chǎn)品等中去。最廣泛應(yīng)用的溴系阻燃劑包括多溴聯(lián)苯醚(polybrominateddiphenyleSters)、六溴環(huán)十二烷(heXabromocyclodecane)和四溴雙酚A(tetrabiSp

2、henolA)，其中四溴雙酚A是市場上應(yīng)用最廣泛的溴系阻燃劑，由于它的生物累積性以及遷移性對環(huán)境造成了持久的危害。據(jù)報道n≥BPA在各種環(huán)境介質(zhì)中普遍存在，比如水，空氣，土壤甚至人體中。TBBPA對水生生物具有很高的急性毒性效應(yīng)，但關(guān)于TBBPA對水生生物的亞慢性毒性效應(yīng)的研究很少，分子和基因表達(dá)分析的研究更是少之又少。櫛孔扇貝(劬砌妙細(xì)化，f)是我國沿海重要的養(yǎng)殖貝類，本文以櫛孔扇貝作為研究對象，分別從酶學(xué)水平和分子水平研究了TBBPA對櫛孔扇貝的毒性效應(yīng)，并運(yùn)用抑制消減雜交技術(shù)篩選出櫛孔扇貝在TBBPA脅迫下的差異表達(dá)基因，為后續(xù)基因芯片的研究提供了理論基礎(chǔ)。1四溴雙酚A對櫛孔扇貝

3、毒性效應(yīng)的研究本文研究了TBBPA對櫛孔扇貝(C辦f口彬丘胱一)的毒性作用，實(shí)驗選取櫛孔扇貝幼貝、成貝殼高分別為(1旬±o_15_)cm、(4．6士0．2)cm。設(shè)置櫛孔扇貝幼貝、成貝急性毒性實(shí)驗梯度：2、2．8、3．92、5．488、7．6832mg／L和1、1．4、1．96、2．744、3．8146mg／L(間隔系數(shù)為1．4)，櫛孔扇貝成貝亞慢性毒性實(shí)驗梯度：50、100和200斗∥L，且均以自然海水作為對照組。結(jié)果顯示：櫛孔扇貝幼貝和成貝在24h、48h、72h、96h的LC50分別為5．924、4．169、3．095、2．614mg／L和2．458、1．657、1．502、1．

4、342mg／L。TBBP：A對櫛孔扇貝組織AHH、GST、SOD活力和DNA損傷(F值表示)影響顯著(P

5、>O．05)；100、200}lg／L處理組F值在9d內(nèi)成峰值變化，并分別于3d、ld達(dá)到最小值，并于9d后恢復(fù)至對照組水平(P>0．05)。消化盲囊組織中各處理組F值在15d內(nèi)呈峰值變化，并均于6d達(dá)到最大值，15d后恢復(fù)至對照組水平(尸>O．05)。由此可見，櫛孔扇貝在TBBPA脅迫下急性毒性效應(yīng)明顯，組織解毒代謝酶活力表現(xiàn)出明顯的時間、劑量效應(yīng)性，鰓絲、消化盲囊AHH、GST和SOD活力可作為櫛孔扇貝TBBPA污染評價的潛在生物標(biāo)志物。2櫛孔扇貝芳烴受體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(銣RNT)基因的克隆與序列分析本研究通過相近物種的m礬T氨基酸序列比對，設(shè)計兼羌引物釣取核心片段及運(yùn)用R丑ce法擴(kuò)全長

6、。結(jié)果得到櫛孔扇貝AI冰T序列1268bp，包括1020bp的OI江，起始密碼子ATG，終止密碼子，IAG，該序列共編碼340個氨基酸，等電點(diǎn)(pI)為7．868，分子量37．70845kDa。將櫛孔扇貝的氨基酸序列通過多重序列比對后發(fā)現(xiàn)與其他物種有較好的保守性，同源性較高。組織特異性分析AI礬T基因在鰓、消化盲囊、閉殼肌、足和外套膜中均有分布，其中鰓組織中的表達(dá)量相對最高，而在外套膜表達(dá)量相對最低。3櫛孔扇貝在．11誑PA脅迫下基因表達(dá)分析的研究本研究運(yùn)用抑制消減雜交技術(shù)篩選TBBPA脅迫下的差異基因。正反向共測序316個克隆，除去序列較短以及測序失敗的樣品，共得到247個EST序列

7、，其中正向消減文庫203個，反向消減文庫44個，文庫中EST序列與已知基因的匹配率達(dá)到78．16％。運(yùn)用B1ast290軟件對序列進(jìn)行分類，反向文庫包括：細(xì)胞分化(2％)，細(xì)胞過程(31％)，死亡(5％)，代謝過程(32％)，生物周期(9％)，定位(7％)，應(yīng)激(14％)；正向文庫包括：細(xì)胞過程(23％)，免疫過程(1％)，死亡(5％)，應(yīng)激(3％)，細(xì)胞組成(3％)，新陳代謝(19％)，細(xì)胞凋亡(1％)，發(fā)育過程(5％)，生命周期(10％)，