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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文NGAL在胃癌中的調(diào)控機(jī)制研究姓名：汪勝利申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：陶厚權(quán)2012-05-21溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文NGAL在胃癌中的調(diào)控機(jī)制研究中文摘要目的構(gòu)建NGAL真核表達(dá)載體pcDNA3．I+／NGAL+及NGAL反義表達(dá)載體pcDNA3．I+／NGAL一，轉(zhuǎn)染胃癌SGC一7901細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞內(nèi)NGAL表達(dá)水平改變對SGC一7901細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，進(jìn)一步闡明NGAL在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法1、提取正常胃粘膜組織的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成
2、cDNA，以此cDNA為PCR模板擴(kuò)增出NGAL基因的ORF序列；PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切、連接反應(yīng)插入DcDNA3．1+表達(dá)載體，從而構(gòu)建NGAL真核表達(dá)載體pcDNA3．I+／NGAL+及NGAL反義表達(dá)載體pcDNA3．I+／NGAL一。2、重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染SGC-7901胃癌細(xì)胞，采用熒光定量PCR檢測細(xì)胞中NGAL的相對表達(dá)水平，選取NGAL表達(dá)水平最高的SGC一7901細(xì)胞克隆(SGC一7901／NGAL+)和NGAL表達(dá)水平最低的SGC-7901細(xì)胞克隆(SGC一7901／NGAL一)，再經(jīng)M
3、TT試驗(yàn)、遷移試驗(yàn)及侵襲試驗(yàn)觀察NGAL基因?qū)ξ赴┘?xì)胞SGC-7901增殖、遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果1、成功構(gòu)建了NGAL真核表達(dá)載體pcDNA3．I+／NGAL+及NGAL反義表達(dá)載體pcDNA3．I+／NGAL一。2、通過重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染、熒光定量PCR檢測，成功獲得NGAL表達(dá)水平最高的SGC一7901／NGAL+細(xì)胞及表達(dá)水平最低的SGC一7901／NGAL一細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，72h后，SGC-7901／NGAL一細(xì)胞的相對增殖率為SGC一7901／NGAL+的1．33倍。遷移實(shí)驗(yàn)表明
4、，24小時后穿過膜的SGC一7901／NGAL一細(xì)胞數(shù)達(dá)到206．2±24．01個，而穿過膜的$GC一7901／NGAL+細(xì)胞僅143．2±25．2個，SGC一7901／NGAL一細(xì)胞的遷移活性為SGC-7901／NGAL+細(xì)胞的1．44倍。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，48小時后穿過膜的SGC一7901／NGAL一細(xì)胞數(shù)達(dá)到52．4±15．6個，而穿過膜的SGC一7901／NGAL+僅29．2±9．1個，$GC-7901／NGAL一細(xì)胞的侵襲活性為SGC一790J／NGAL+細(xì)胞的1．79倍。結(jié)論體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)N
5、GAL基因可抑制胃癌SGC一7901細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。關(guān)鍵詞：NGAL；胃癌；增殖：侵襲；遷移溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文StudyofRegulationMechanismofNGALinGastricCancerABSTRACTPurposeToconstructNGALeukaryoticexpressionvectorpcDNA3．1+／NGAL+andNGALantisenseexpressionvectorpcDNA3．1+／NGAL一，andstudytheeffectofNGALo
6、ncellproliferation，invasionandmetastasisofSGC一7901invitro．Methods1，TotalRNAwasextractedfromthenormalgastricmucosaltissue，andconvertedintoeDNAbyRTreaction．NGALORFwasamplifyedbyPCRusingeDNAastemplate．ThePCRproductwasthencutbyrestrictionenzyme，andclonedint
7、opcDNA3．1+vectorinsenceorantisencetoconstructNGALexpressionvectorpeDNA3．1+／NGAL+andNGALantisenseexpressionvectorpcDNA3．1+／NGAL一．2TheRecombinantplasmidDNAweretransfectedintogastriccancercellsSGC一7901．ThenthemRNAlevelofNGALinSGC-7901weredeterminedbySYBRGr
8、eenbasedquantitativePCR．a(chǎn)ndSGC-7901cellcloneswiththehighestNGALlevel(SGC-7901／NGAL+)orlowestNGALlevel(SGC一7901／NGAL一)werechoosed．Then，MTTassay,invitrocellmigrationandinvasionassayswereperformedtoevaluatetheeffectofNGALoncellproli
