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《芥菜型油菜胞質不育hau cms不育相關基因的鑒定及其功能分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、華中農(nóng)業(yè)大學博士學位論文芥菜型油菜胞質不育HauCMS不育相關基因的鑒定及其功能分析姓名：景兵申請學位級別：博士專業(yè)：作物遺傳育種指導教師：傅廷棟201206芥菜型油菜胞質不育HauCMS不育相關基因的鑒定及其功能分析摘要細胞質雄性不育(CMS)是油菜雜種優(yōu)勢利用的主要途徑。目前，國內外主要應用的油菜CMS系統(tǒng)有oguraCMS和polimaCMS，其中ogura系統(tǒng)在歐洲應用較多，國內主要使用傅廷棟教授于1972年發(fā)現(xiàn)的polima胞質不育系統(tǒng)。然而，生產(chǎn)上雜交種的胞質單一化存在著潛在風險。因此，鑒定新的細胞質雄性不育類型及其胞質不育基因對于實現(xiàn)雜交種胞質來源
2、多樣化具有重要意義。本研究以hauCMS原始芥菜型油菜和轉育的甘藍型油菜保持系和不育系為實驗材料，通過對hau胞質線粒體基因及側翼特異區(qū)域進行序列結構及其表達，翻譯分析；并進一步通過原核表達及植物遺傳轉化的方法，對hau胞質特異的異常開放讀碼框進行功能分析，鑒定hau胞質的不育相關基因。本研究的主要結果如下：1．hau胞質線粒體基因組特異區(qū)段的分析通過對不育系線粒體的功能基因側翼序列進行染色體步移(genomewalking)及序列對比分析，發(fā)現(xiàn)hauCMS線粒體atp6基因的下游與其芥菜型油菜保持系，甘藍型油菜保持系存在明顯差異。進一步對該區(qū)域進行BLAST分
3、析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域可能包含一異常開放讀碼框(chimericopenreadingframe)——D護娓與已報道的tour胞質的同源區(qū)域相似度較高(99．5％)。在所比較的序列內有四個位點的差異，hauCMS相對于tour胞質有三個堿基(485bp，785bp，802bp)的置換和一個堿基(764bp)的缺失，該開放閱讀框與甘藍型油菜油菜nap胞質線粒體orf286同源性為93％。2．hau胞質不育相關區(qū)域atp6／orf288的表達分析通過RT-PCR和northern雜交分析，證實了atp6和orf288在不育系線粒體中共轉錄；對orf288編碼的氨基酸序列和結
4、構進行分析，推測其編碼的蛋白N端包含3個跨膜區(qū)。為了進一步驗證orf288在不育系中可以翻譯成蛋白，我們合成了ORF288部分氨基酸序列用于制各其特異的多克隆抗體。通過特異的多克隆抗體對不育系線粒體蛋白和花蕾總蛋白進行western雜交，結果表明orf288在hauCMS不育系中翻譯成大小約32kD的蛋白。華中農(nóng)業(yè)大學2012屆博士論文3．ORF288對大腸桿菌宿主茵具有毒害作用細胞質不育基因通過影響線粒體物質和能量代謂十而導致植物雄性器官發(fā)育異常，而線粒體起源于共生在真核細胞中的細菌。因此，一些研究表明不育基因在大腸桿菌中表達，會抑制大腸桿菌的生長或對其具有致
5、死作用。我們將orf288連入原核表達載體PET32a，在IPTG誘導下在BL21(DE3)菌株中表達。結果表明ORF288對大腸桿菌宿主細胞的增殖具有明顯的抑制作用。這一結果說明orf288對大腸桿菌具有毒害作用，可能以同樣的方式作用于植物線粒體，并進一步影響雄蕊發(fā)育。4．orf288的擬南芥遺傳轉化植株雄蕊敗育為了進一步驗證orf288的功能，我們構建了4個植物轉化載體：(1)VNO：包含35S啟動子，酵母Y187菌株coxlV基因的線粒體定位信號和orf288編碼序列；(2)vy3：包含擬南芥AP3基因啟動子，酵母Y187菌株coxlV基因的線粒體定位信號
6、和orf288編碼序列；(3)VNII：包含擬南芥AP3啟動子序列和orf288開放閱讀框；(4)AGUS：4丹啟動子驅動的GUS基因的載體。擬南芥轉基因結果表明，VN3和VNII載體80％的轉化植株表現(xiàn)為雄蕊敗育，而VNO載體和AGUS對照載體轉化植株的育性并沒有變化。5．OI心288的亞細胞定位擬南芥轉化實驗表明，orf288在轉化植株中表達能夠導致植物育性的變化。其中VNII載體轉化植株表型與VN3一致。因此，我們推測orf288在細胞質基質中可以行使其功能或其自身可以定位到線粒體(在線粒體外表達)。通過PredSL和TargetP對ORF288氨基酸進行
7、軟件預測分析，其N端可能包含一段線粒體定位信號。為了進一步闡明orf288具有自身的線粒體定位信號，我們將其融合在GFP的N端，通過PEG介導的方法轉化擬南芥原生質體，擬南芥原生質體瞬時表達結果表明，ORF288不需要外源信號肽協(xié)助就可以將自身定位到植物線粒體上。關鍵詞：芥菜型油菜，細胞質雄性不育，orf288，毒蛋白，線粒體蛋白，轉基因植株II芥菜型油菜墮墾至直!!竺竺竺璺至童塑莖苧里竺竺塞墨莖墊堡坌塹—————-_————————————————————————————————————————————————_———————_—————-——————————
8、————————一一Ab
