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1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文利用生物工程技術(shù)創(chuàng)造甜菜耐鹽新種質(zhì)姓名：楊愛芳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：發(fā)育生物學(xué)指導(dǎo)教師：張舉仁20031105原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對(duì)本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名:聾業(yè)土一日期:7.004.ii.J.關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解山東大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送
2、交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱;本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。(保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論文作者簽名14牛導(dǎo)師簽名:澎犯日期:20咔u,S.山東大學(xué)博士學(xué)位論文利用生物工程技術(shù)創(chuàng)造甜菜耐鹽新種質(zhì)摘要甜菜(Beta。妙risL.)是重要的糖料和飼料作物，糖用甜菜提供了全球40%以上的食糖，飼料甜菜是家畜最佳的多汁飼料，塊根肥大，營(yíng)養(yǎng)豐富。甜菜具有耐鹽潛質(zhì)，能在鹽分低于0.4%的土壤中正常生長(zhǎng)。甜菜的一些近緣野生種起源于濱海，耐鹽性較強(qiáng)。飼用
3、甜菜雖生物量大，耐鹽性卻不高。因此，高耐鹽性飼用甜菜的開發(fā)和利用，不僅可充分開發(fā)利用濱海鹽堿地，推動(dòng)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，而且能有效改善生態(tài)環(huán)境。采用常規(guī)育種技術(shù)培育甜菜耐鹽品種周期長(zhǎng)，見效慢，至今還沒有培育出適合濱海鹽堿地種植的品種.采用生物工程技術(shù)可以獲得耐鹽性大幅度提高的工程植株，并能縮短育種年限，這為甜菜耐鹽育種開辟了新途徑.通過耐鹽細(xì)胞突變體篩選等技術(shù)，可創(chuàng)造出甜菜耐鹽新種質(zhì)。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可將從細(xì)菌和鹽生植物中克隆的耐鹽基因?qū)胩鸩?，獲得高度耐鹽的優(yōu)良甜菜新種質(zhì)。本論文的目標(biāo)就是綜合利用細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)，培育適合在我國(guó)中低度濱海鹽堿地中種植的耐鹽
4、飼用甜菜新品系。以14個(gè)甜菜品種的幼胚、葉柄和沙培小苗下胚軸切段為材料，分別誘導(dǎo)愈傷組織并繼代培養(yǎng)。研究了影響愈傷組織誘導(dǎo)頻率的因素，對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)及分化的條件也進(jìn)行了探索.發(fā)現(xiàn)同一基因型甜菜的不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率存在差異。幼胚較易產(chǎn)生愈傷組織，下胚軸、葉柄、葉片則較難。不同基因型的外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率有明顯差異。外植體的發(fā)育時(shí)期和生理狀態(tài)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有明顯影響。經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)，從4個(gè)基因型的幼胚得到了顏色為乳白或淡黃、結(jié)構(gòu)疏松、顆粒狀的胚性愈傷組織.胚性愈傷組織在MS十5%蔗糖附加0.05m叭ABA或附加。.05mg/LZT+0.05m
5、叭ABA的分化培養(yǎng)基上通過胚狀體發(fā)生途徑再生植株。不同基因型材料再生植株的最適培養(yǎng)基組合有差異。從下胚軸和葉柄誘導(dǎo)的愈傷組織由于誘導(dǎo)率低且繼代培養(yǎng)難度大，只得到了少量胚性愈傷組織，未能獲得再生植株。部分胚性愈傷組織經(jīng)5^-20Gy劑t的60C。一Y射線輻照后，在附加不同濃度鹽分(1.0%^'2.5%NaCI)的培養(yǎng)基上連續(xù)篩選三代，獲得穩(wěn)定耐1.5%NaCl的耐鹽山東大學(xué)博士學(xué)位論文細(xì)胞系。在分化培養(yǎng)基上耐鹽細(xì)胞系通過胚狀體發(fā)生途徑再生耐鹽植株。再生植株自交后代(Rl)播種在沙盆中，每天澆灌2.0%^-3.0%NaCI水溶液。有18個(gè)株系可在2.0%NaC
6、l溶液中長(zhǎng)期生長(zhǎng)，6個(gè)株系在2.5%濃度下能萌臀但在生長(zhǎng)過程中因鹽害影響而下胚軸枯死，植株死亡。對(duì)照在2.0%NaCl溶液篩選中沒有存活苗。這些結(jié)果表明以甜菜愈傷組織為材料，通過輻射誘變和定向篩選創(chuàng)造甜菜耐鹽育種材料是可行的.以20個(gè)基因型甜菜的幼嫩花序頂端切段為外植體，在附加lm叭6-BA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽發(fā)生。3周后不同基因型的花序切段均有不定芽發(fā)生，誘導(dǎo)率達(dá)到90%以上.花序切段產(chǎn)生不定芽的速率隨基因型而異，一般在接種后10^-20天發(fā)生。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不定芽大量產(chǎn)生，密集成叢。將叢生芽塊剪成小塊繼代培養(yǎng)，每15天繼代一次。繼代培養(yǎng)3次后
7、，每代每個(gè)芽可產(chǎn)生5^-8個(gè)次生芽，芽的增殖頻率為每月1:20^30或更高。切下叢生芽塊上較大的單芽，在附加lm叭NAA的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。一般兩周內(nèi)白色粗壯的根發(fā)生，生根率50^80%。生根率與芽的年齡、大小及生理狀態(tài)有關(guān)，生長(zhǎng)較快的大芽易產(chǎn)生根系。生根植株移栽到花盆，新根系產(chǎn)生后定植于大田。甜菜叢生芽發(fā)育的小苗生根率因基因型不同而有明顯的差異，一般在75%以上，少數(shù)基因型的試管苗移栽成活率高達(dá)98%.將繼代培養(yǎng)過程中旺盛增殖的叢生芽塊剪成小芽，經(jīng)10^20Gy劑量的60Co-Y射線輻照，結(jié)合1.0%^2.5%NaCl的直接篩選，獲得了耐2.0%Na
8、Cl的小叢生芽并再生植株。再生植株自交后代(R,)播種在沙盆中，澆
