四物湯對血虛證小鼠細(xì)胞凋亡影響的研究

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1、廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是個(gè)人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外，本論文不合任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名量垂至1日期：掃7午年6月多日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解廣州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門機(jī)構(gòu)途交論文的復(fù)印件和電子版，允許被查閱和借閱。本人授權(quán)廣州中醫(yī)藥大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢

2、索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。(保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論文作者簽名±正墨2論文導(dǎo)師簽名日期：2。I午年舌月籮日摘要目的：觀察四物湯對血虛證小鼠肝細(xì)胞、T細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl一2和Fas表達(dá)和凋亡啟動(dòng)分子Caspase8、執(zhí)行分子Caspase3表達(dá)的影響。方法：60只C57BL／6J小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、四物湯低劑量組、四物湯中劑量組、四物湯高劑量組以及肌苷組。以腹腔注射環(huán)磷酰胺建立血虛證模型。模型組、四物湯低、中、高劑量組及肌苷組于實(shí)驗(yàn)第ld按小鼠體重0．19／kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺1次，空白組予等體積生理鹽水腹腔注射。四物湯低

3、劑量組予59·kg～·d～、中劑量組予lOg·kg～·d～、高劑量組予209·kg～·d。1灌胃，肌苷組予0．06g·kg一·d1灌胃?？瞻捉M和模型組則予以等體積生理鹽水。每日1次，連續(xù)灌胃7d。在實(shí)驗(yàn)第7d，給藥1h后，每只小鼠眼眶后靜脈叢取血，采血量約0．1mL，采用全自動(dòng)血液分析儀檢測外周血象。在實(shí)驗(yàn)第8d，頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取肝臟、脾臟及胸腺。稱量脾臟及胸腺質(zhì)量以計(jì)算脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。肝右葉切取1．OcmX1．OcmX1．Ocm組織塊，以10％甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡。取脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液，免疫磁珠法分離純化T細(xì)胞，制作細(xì)胞涂片，TUNEL法檢

4、測T細(xì)胞凋亡。取肝左葉-80℃保存，以備用于總RNA和蛋白提取。熒光定量PCR法檢測Bax、Bcl一2及FasmRNA表達(dá)。先將RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)條件為，25。C溫育lOmin，42℃溫育50min，95℃加熱5min。再取cDNA進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性2min，95。C變性30s，58℃退火30s，72℃延伸lmin，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸5min。采集每個(gè)樣品Ct值，比較各組的mRNA表達(dá)水平。Westernblot檢測Caspase3、Caspase8表達(dá)。先制備SDS-PAGE凝膠，10％分離膠8mL和5％濃縮膠4mL。室溫放置40min至膠凝

5、固。再將樣品蛋白和電泳上樣緩沖液混合，進(jìn)行蛋白變性，反應(yīng)條件為95℃lOmin，然后做蛋白電泳。接著將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，反應(yīng)條件為65V，2h。取出轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，封閉1h。將封閉后的膜放入一抗中，4℃反應(yīng)過夜。將反應(yīng)膜用1×TBST洗滌，洗滌3次，每次10min。將洗滌后的膜放入二抗中，室溫孵育1h。再用1XTBST洗滌，洗滌3次，每次10min。以電化學(xué)發(fā)光法顯影，再曝光及洗片，采用凝膠成像系統(tǒng)，對膠片進(jìn)行掃描，檢測條帶灰度值，做蛋白半定量分析。結(jié)果：(1)外周血象：與模型組比較，四物湯中、高劑量組及肌苷組外周血紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)以及血紅蛋白含量均有升高，P<0．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)

6、意義。四物湯低劑量組外周血紅細(xì)胞數(shù)、以及血紅蛋白含量均有升高，P<0．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，白細(xì)胞數(shù)有上升趨勢，P>O．05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四物湯各劑量組血小板數(shù)有上升趨勢，P>O．05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肌苷組血小板數(shù)有下降趨勢，P>O．05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)臟器指數(shù)：與模型組比較，四物湯低、中、高劑量組及肌苷組脾指數(shù)均有升高，P<0．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四物湯低劑量組胸腺指數(shù)有升高趨勢，P>O．05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四物湯中、高劑量組及肌苷組胸腺指數(shù)有下降趨勢，P>O．05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)細(xì)胞凋亡百分率：與模型組比較，四物湯低、中、高劑量組肝細(xì)胞凋亡百分率均降低，P<0．05，有統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義。肌苷組肝細(xì)胞凋亡百分率有下降趨勢，P>O．05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四物湯中、高劑量組T細(xì)胞凋亡百分率均降低，P<0．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四物湯低劑量組和肌苷組T細(xì)胞凋亡百分率有下降趨勢，P>O．05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)：與模型組比較，四物湯高劑量組和肌苷組促凋亡基因Bax和FasmRNA表達(dá)水平降低，P<0．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四物湯低劑量組和中劑量組Bax和FasmRNA表達(dá)水平有下降趨勢