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《人胚胎干細(xì)胞向胰島素陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系優(yōu)化論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、原創(chuàng)性聲明本人聲I{月，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究j』：_：=作及取得的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文·}14≮包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得·f_l肖火學(xué)或其他單位的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我．t1：Ml：作的I司志對(duì)本研究所作的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明。作者簽名：絲盔盔日期：絲年叢月旦日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本人J7解tl一南人學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文)i：根據(jù)皤家或湖南省有關(guān)部門(mén)規(guī)定送交學(xué)位論文，允許學(xué)位論文被憊閱和f齡閱；學(xué)校呵以公布
2、學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，nJ’以采用復(fù)印、縮印或其它?。伪４鎸W(xué)位論文。
3、司時(shí)授權(quán)中困科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《t”}．I困學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)》，并通過(guò)列絡(luò)向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。擎．——廣人胚胎千細(xì)胞向胰島素陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系的優(yōu)化摘要第一章人胚胎干細(xì)胞(hESCs)向胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化的比較目的：通過(guò)比較文獻(xiàn)中已報(bào)道的效率較高的誘導(dǎo)方案，找到在本實(shí)驗(yàn)室條件下獲得胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞的最佳誘導(dǎo)方案。方法：體外誘導(dǎo)hESCs需要依次經(jīng)歷限定性內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)分泌前體最終才會(huì)成為胰島素陽(yáng)性細(xì)胞，這是體內(nèi)p細(xì)胞發(fā)育分化過(guò)程的重演。利用本實(shí)
4、驗(yàn)室已經(jīng)建立好的條件，將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)至限定性內(nèi)胚層階段。然后分三組分別用D’Amour、HongkuiDeng、Hosoya實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的誘導(dǎo)方案將細(xì)胞往胰腺內(nèi)分泌前體誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)的第10天以及第13天收集樣本，用免疫熒光、間標(biāo)流式、real．timePCR等檢測(cè)手段比較三種誘導(dǎo)方案獲得胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞的效率。結(jié)果：僅Hosoya小分子方案組在第10天至第13天的過(guò)程中PDXl+細(xì)胞的比例出現(xiàn)明顯的上調(diào)；D’Amour組呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)；HongkuiDeng組呈現(xiàn)基本持平狀態(tài)。僅Hosoya小分子方案組在第10天至第13天能持續(xù)檢測(cè)到較多的NGN3
5、+細(xì)胞；D’Amour組呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且NGN3+細(xì)胞比例很低；HongkuiDeng組幾乎檢測(cè)不到NGN3+細(xì)胞。結(jié)論：僅Hosoya小分子方案能更好的將限定性內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞(PDXl+&NGN3+)。第二章人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽(yáng)性(Ins+)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究目的：比較基礎(chǔ)培養(yǎng)基：D／F一12、高糖．DMEM；成熟因子方案與Hosoya的小分子方案獲得胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的效率。方法：利用第一章所得到的優(yōu)勢(shì)方案(小分子誘導(dǎo)方案)，將hESCs誘導(dǎo)至胰腺內(nèi)分泌前體起始階段，即誘導(dǎo)的第10天。然后將細(xì)胞分為兩大組，其
6、中一組用成熟因子方案誘導(dǎo)，另一組繼續(xù)用IIHosoya實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的小分子方案誘導(dǎo)；分別考察兩種誘導(dǎo)方案下，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不同葡萄糖濃度在誘導(dǎo)第18天獲得Ins+細(xì)胞的差異。用免疫熒光、間標(biāo)流式、real—timePCR等檢測(cè)手段比較各方案獲得Ins+細(xì)胞的效率。結(jié)果：高糖．DMEM加成熟因子組在誘導(dǎo)的第18天獲得Ins十細(xì)胞的效率最高，達(dá)27．43％+2．97％。D／F．12加成熟因子組、高糖一DMEM加小分子組和D／F．12加小分子組的Ins+細(xì)胞比例都不及21％。而追溯到誘導(dǎo)的第13天檢測(cè)成熟因子5fid,分子組在表達(dá)胰腺內(nèi)分泌前體階段標(biāo)記基因顯示成熟
7、因子組PDXl、NGN3、Beta2基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量是小分子組的數(shù)倍結(jié)論：培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)終末形成Ins+細(xì)胞效率在成熟因子組中高糖能促使p細(xì)胞增殖，低糖能使細(xì)胞內(nèi)Ins含量增加；而在小分子組中無(wú)區(qū)別。在獲得Ins+細(xì)胞效率上高糖．DMEM加成熟因子比小分子方案有優(yōu)勢(shì)，其原因可能并不是胰腺內(nèi)分泌前體階段，PDXl+&NGN3+細(xì)胞數(shù)量的多少，而與其PDXl和NGN3表達(dá)量有關(guān)。推測(cè)PDXl、NGN3的表達(dá)可能存在一個(gè)閾值是激活其下游基因啟動(dòng)所必須的。第三章帚二早人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)方案的優(yōu)化目的：以高糖．
8、DMEM加成熟因子誘導(dǎo)方案為基礎(chǔ)優(yōu)化人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞向胰島素陽(yáng)性細(xì)胞誘導(dǎo)方案方法：利用第一章所得到的優(yōu)勢(shì)方案(小分子誘導(dǎo)方案)，將hESCs誘導(dǎo)至胰腺內(nèi)分泌前體起始階段，即誘導(dǎo)的第10天。以第二章中高糖．DMEM加成熟因子誘導(dǎo)方案為基礎(chǔ)進(jìn)行分組，將成熟因子Betacellulin、Exendin．4、IGF．1進(jìn)行自由組合，分為無(wú)因子組、單因子組、雙因子組、三因子組。將細(xì)胞誘導(dǎo)至第18天，用免疫熒光、間標(biāo)流式、real—timePCR等檢測(cè)手段比較各方案獲得Ins+細(xì)胞的效率。結(jié)果：在誘導(dǎo)第18天獲得Ins+細(xì)胞比例最高的三組分別為雙
9、因子組中的Exendin一4&IGF一1、單因子組中的Exendin一4及IGF
