rnai介導(dǎo)抑制mcf-7細(xì)胞中vegf基因表達(dá)

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1、碩士論文RNAi介導(dǎo)抑制MCF_7細(xì)胞中、，EGF基因表達(dá)摘要血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是促血管生長(zhǎng)的最關(guān)鍵因子之一，而血管的生成在腫瘤的生長(zhǎng)過程中起著至關(guān)重要的作用。RNA干擾(RNAinterference，RN越)技術(shù)是一種高效地、特異性地抑制目的基因表達(dá)的技術(shù)，因此利用RNAi技術(shù)抑制VEGF基因表達(dá)，可以抑制血管的生成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建的三種靶向VEGF的質(zhì)粒及四種化學(xué)合成的siRNA，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其體外轉(zhuǎn)染到人的乳腺癌MCF．7細(xì)胞中，應(yīng)用細(xì)胞生

2、物學(xué)的方法檢測(cè)其抑制VEGF基因表達(dá)及抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，以期為RNA干擾在腫瘤治療方面的研究提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本論文主要通過以下幾個(gè)方面對(duì)靶向VEGF的質(zhì)粒及siRNA進(jìn)行研究：(1)首先通過GFP標(biāo)記的VEGF高表達(dá)質(zhì)粒QⅦGMP)轉(zhuǎn)染MCF．7細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染時(shí)間、轉(zhuǎn)染試劑濃度比及細(xì)胞接種密度為條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染最佳條件的篩選實(shí)驗(yàn)；(2)將靶向VEGF的三個(gè)pSilencer質(zhì)粒分別與GFP標(biāo)記的VEGF高表達(dá)質(zhì)粒依照最佳轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，利用倒置熒光顯微鏡觀察pSilcncer質(zhì)粒對(duì)VEGF基因表達(dá)的抑制情況，利用MTT法檢測(cè)pSilencer質(zhì)粒

3、對(duì)MCF．7細(xì)胞增殖的抑制情況；(3)將化學(xué)合成的四種siRNA轉(zhuǎn)染MCF．7細(xì)胞，分別利用MTT、ELISA、RT-PCR檢測(cè)siRNA對(duì)細(xì)胞增殖的抑制、VEGFmRNA的合成及VEGF蛋白表達(dá)抑制情況，從四種不同的siRNA中篩選得到抑制效果最好的一種siRNA：(4)將篩選得到抑制效果較好的化學(xué)合成的asiRNA21／23進(jìn)行進(jìn)一步研究，利用活體細(xì)胞在線培養(yǎng)系統(tǒng)、AnnexinV：-FITC／PI雙染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)asiRNA21／23對(duì)MCF．7細(xì)胞的增殖抑制情況及其促凋亡作用。關(guān)鍵詞：MCF．7；RNAi；VEGF；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡碩士論

4、文AbstractThevascularendothelialgrowthfactorwasoneofthemostimportantangiogenesisfactorswhichplayakeyroleintheprocessoftumorgrowth．RNAinterferenceWaSaspecificinhibitionofgeneexpressiontechnology．TheRNAiWaSusedtoinhibittheangiogenesisandtumorcellsproliferation．TheplasmidsandsiRNAtar

5、getedVEGFweretransfectedintoMCF-7cellsusinglipofectamineTM2000，andcellbiologicaldetectionmethodswereusedtodetectthepharmacologicalactionoftheseplasmidsandsiRNAinvitro．TheplasmidhighlyexpressingVEGFproteinwhichmarkeredwithgreenfluorescent(VEGF-GFPplasmid)WastansfectedintoMCF-7，and

6、threefactorsabouttransfectioneffect：transfertime，theratioofreagemconcentrationandthecelldensitywereobtainedbycountingthepercentageofthefluorescentcellnumberinthetotalcellnumber．TheinhibitioncellsproliferationeffectofthreeplasmidstargetedVEGFgenew．ereobservedbycountingfluorescentc

7、ellsusingmicroscopyandMTTmethod，whenthesethreeplasmidsrespectivelywiththeVEGF-GFPplasmideo-trasfectedintoMCF-7for48h．FourspecificRNAseriesweredesigned(siRNA21／21、asiRNAl9／21、siRNA23／23、asiRNA21／23)andsynthesized．ThesiRNAwastransfectedintoMCF-7cellsusinglipofectamineTM2000．111eceU

8、proliferationeffectWaSobservedusingMTTme