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《重組人胸腺肽α1表達與純化 - 《廈門大學(xué)學(xué)報（自然 》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、重組人白細胞介素-13在大腸桿菌中的表達純化及鑒定林輝煌1,2，劉春鳳2，尹鳳紅2，丁玉梅1，陳清西1*(1.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361005；2.廈門特寶生物工程股份有限公司，福建廈門361028)摘要：本文采用大腸桿菌作為宿主表達重組人白細胞介素-13（rhIL-13）融合蛋白，經(jīng)分離純化獲得高純度、高活性的rhIL-13。通過300L發(fā)酵罐進行中試發(fā)酵表達rhIL-13融合蛋白；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，離心發(fā)酵液收集菌體，菌體經(jīng)溶解、變性、稀釋復(fù)性和親和層析捕獲，獲得融合蛋白；融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切后，經(jīng)親和層析分離和分子篩精細純化等步驟后，獲得高純度rh
2、IL-13原液。每升發(fā)酵液可獲得高純度的rhIL-13原液約30mg。通過本純化工藝獲得的rhIL-13原液經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法檢測純度大于98.75%；經(jīng)高效液相色譜分子排阻（HPLC-SEC）法檢測純度結(jié)果為100%；質(zhì)譜法分析rhIL-13分子質(zhì)量，結(jié)果為12348u，與理論值基本一致；采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法進行比活性檢測，檢測結(jié)果大于8.0×106IU/mg；采用HPLC法和質(zhì)譜法對rhIL-13二硫鍵數(shù)目和位置進行了分析，結(jié)果顯示二硫鍵數(shù)目和位置與理論一致。關(guān)鍵詞：重組人白細胞介素-13；純化；鑒定中圖分類
3、號：Q356．1文獻標志碼：A文章編號：白細胞介素-13(IL-13)是一種多功能細胞因子，主要由T細胞、嗜堿粒細胞、漿細胞及樹突狀細胞等在活化狀態(tài)下分泌產(chǎn)生的，尤其是Ⅱ型輔助性T細胞（Th2）[1]。IL-13可誘導(dǎo)單核細胞分化，增強其MHCⅡ類分子的表達[2]；抑制LPS誘導(dǎo)的單核因子分泌，控制炎癥反應(yīng)；誘導(dǎo)B細胞增殖及合成IgE類抗體，增強B細胞表面MHCⅡ類分子、CD23及CD72的表達[3]；協(xié)同IL-2刺激NK細胞產(chǎn)生IFN，從而促進單核－巨噬細胞活化和TH1型細胞免疫反應(yīng)。IL-13還具有抑制HIV-1在巨噬細胞內(nèi)復(fù)制，誘導(dǎo)中性粒細胞中IL-1RA
4、基因表達和蛋白質(zhì)合成等多種功能[4]。重組人白細胞介素-13為一條非糖基化的單鏈多肽，含112個氨基酸殘基，兩對二硫鍵，分子量約為12.3kD；氨基酸序列為：GPVPPSTALRELIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN。收稿日期：2016-01-11錄用日期：2016-03-08基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展（863）計劃（2007AA021604）*通信作者：chenqx@xmu.edu.cn11目前
5、重組人IL-13（rhIL-13）基本上都是采用基因工程方法，通過對其cDNA加入特定的標簽和引物后，進行PCR擴增，插入到質(zhì)粒中經(jīng)DNA重組后，篩選陽性克隆，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的細胞中，進行發(fā)酵表達獲得融合蛋白，再通過對融合蛋白酶切和下游純化獲得IL-13蛋白。本文采用基因工程技術(shù)構(gòu)建的高效表達rhIL-13融合蛋白的表達菌株進行300L發(fā)酵融合蛋白，經(jīng)變性、復(fù)性以及親和層析、分子篩層析等分離純化后獲得高純度、高活性的rhIL-13，為rhIL-13工業(yè)化生產(chǎn)打下堅實的基礎(chǔ)。1主要材料大腸桿菌BL-21/pColdⅡ-IL-13基因工程菌株由本實驗室構(gòu)建并保存；酵母
6、提取物和蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品，丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品；ChelatingSepharoseFastFlow（CS）、Superdex75（S-75）填料為GE公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。實驗使用主要儀器：30L、300L全自動發(fā)酵罐，B．BraunBiotech公司；全溫振蕩器，哈爾濱東明醫(yī)療器械廠；離心機，BECKMAN公司；P2B005A01超濾膜，Millipore公司；Basic100蛋白純化儀，GE公司；LC1200高效液相色譜儀，Agilent公司；autoflexIIITOF/TOF串聯(lián)質(zhì)譜儀，BrukerDaltonics公
7、司；DU800紫外/可見光分光光度計，美國貝克曼公司。2實驗方法2.1rhIL-13融合蛋白的發(fā)酵表達挑取rhIL-13工程菌株BL-21/pColdⅡ-IL-13，按1：400（V/V）接種至100mLLB培養(yǎng)基/1000mL三角瓶，pH6.0、37℃、200~250r/min培養(yǎng)OD600為1左右為一級種；一級種子按1：200（V/V）接種至20LLB培養(yǎng)基/30L種子罐，pH6.0、37℃、200~250r/min培養(yǎng)OD600為10左右為二級種。二級種按1：6（V/V）接種到含120LLB培養(yǎng)基的D300發(fā)酵罐中，pH7.0、37℃，溶氧（DO）70%培
8、養(yǎng)、待菌液濃度達OD60
