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《副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法的建立》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法的建立姓名：汪洋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：何啟蓋201206副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法的建立摘要副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。副豬嗜血桿菌至少有15個(gè)血清型。根據(jù)豬健康狀況和菌株毒力的高低，感染后可以造成急性或者慢性的感染。副豬嗜血桿菌感染尤其對(duì)早期斷奶的仔豬造成較大的危害。副豬嗜血桿菌的感染
2、可通過疫苗接種和抗生素治療所控制。但是，對(duì)于疾病控制的基礎(chǔ)是能夠準(zhǔn)確的診斷出致病病原。采用細(xì)菌分離的方法來鑒定副豬嗜血桿菌存在幾個(gè)缺陷，一方面是副豬嗜血桿菌對(duì)生長(zhǎng)條件的要求較高；另一方面是，病豬可能接受過抗生素治療。因此，許多分子診斷方法已被研究和應(yīng)用。在這些檢測(cè)方法中，基于PCR技術(shù)的診斷方法能夠快速、靈敏的檢測(cè)出副豬嗜血桿菌。但是，在PCR擴(kuò)增過程中需要用到的具備精密的熱循環(huán)功能的儀器仍然妨礙PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用。環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增法是一種新的恒溫、高效的核酸擴(kuò)增法。在本研究中，我們以副豬嗜血桿菌高度保守的16SrRNA基因
3、為靶基因，建立了檢測(cè)副豬嗜血桿菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法。天然免疫應(yīng)答是脊椎動(dòng)物對(duì)抗入侵的外界微生物的第一道防線。天然免疫細(xì)胞主要包括中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。作為宿主天然免疫細(xì)胞的重要一員，巨噬細(xì)胞通過直接清除微生物和釋放相應(yīng)的細(xì)胞因子和趨化因子來聚集其它的免疫細(xì)胞到感染部位來發(fā)揮其免疫學(xué)功能。病原菌要在宿主體內(nèi)存活和繁殖，必須要突破宿主的免疫屏障。細(xì)菌的多樣性造成病原特異的巨噬細(xì)胞應(yīng)答。針對(duì)病原菌與宿主相互作用的研究能夠幫助我們理解宿主的防御策略和相應(yīng)的病原菌的逃避策略。有關(guān)副豬嗜血桿菌與豬肺泡巨噬細(xì)胞的相互作用的研究
4、已有學(xué)者報(bào)道。但是未見副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制的報(bào)道。高通量的cDNA芯片技術(shù)為研究宿主與病原菌相互作用提供了一個(gè)有力的工具。該技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到細(xì)胞和組織對(duì)抗病原感染的差異表達(dá)基因的分析中。在本研究中，我們應(yīng)用高通量的cDNA技術(shù)研究豬肺泡巨噬細(xì)胞在副豬嗜血桿菌感染后轉(zhuǎn)錄組的變化來揭示副豬嗜血桿菌感染引起的機(jī)體天然免疫應(yīng)答的機(jī)制。1．副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究應(yīng)用昂飛公司的高通量eDNA芯片，在副豬嗜血桿菌感染后6天的豬肺泡巨噬細(xì)胞中共鑒定到428個(gè)差異表達(dá)的基因。通過對(duì)這些基因進(jìn)行
5、注釋、生物進(jìn)程分析、通路分析、相互作用分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要屬于炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、微管聚合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子。通路分析的結(jié)果表明，主要的通路包括：細(xì)胞吸附分子(曠3．74E一12)、細(xì)胞因子一細(xì)胞因子受體相互作用(曠2．18E．10)、Toll樣受體信號(hào)通路(曠1．93E．05)和MAPK(p=7．63E．04)信號(hào)通路等。通過對(duì)屬于這些通路的差華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆博士學(xué)位論文異表達(dá)基因的分析表明機(jī)體通過不同的策略激活炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答來對(duì)抗副豬嗜血桿菌的感染。特別的，許多差異表達(dá)基因與吞噬作用，吞噬溶酶體形成
6、，細(xì)胞因子產(chǎn)生和一氧化氮產(chǎn)生等巨噬細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)功能的生物進(jìn)程相關(guān)。這些差異基因能夠幫助我們更好的理解巨噬細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)功能的復(fù)雜的機(jī)制。進(jìn)一步，全部428個(gè)基因編碼的蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)和六個(gè)重要的子互作網(wǎng)絡(luò)用STRING和IPA預(yù)測(cè)。通過對(duì)差異表達(dá)基因編碼的蛋白的互作分析表明，大多數(shù)差異表達(dá)基因編碼的蛋白存在相互作用。但是有些差異表達(dá)基因編碼的蛋白之間可能并不存在相互作用或相互作用還沒有被發(fā)現(xiàn)。在差異表達(dá)基因中，我們發(fā)現(xiàn)coroninla，slOOa4和slOOa6三個(gè)基因在許多生物進(jìn)程及通路中發(fā)揮著重要的作用，提示這三個(gè)
7、基因可能是新的副豬嗜血桿菌感染相關(guān)基因。為了研究這三個(gè)基因，我們克隆并測(cè)序了豬的coroninla，slOOa4和slOOa6基因。序列上傳NCBI：coroninlaID：【GeTlBalll(：Ⅲ092377】：s100a4ID：【GenBank：JNl22624．1】；s100a6ID：[GenBank：DQ372082．1】，這三個(gè)基因均為首次在豬中報(bào)道。對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)化樹分析表明，豬的CORONINIA與牛的CORONIN1A聚到一個(gè)分支上；豬的S100A6與馬的S100A6聚到一個(gè)分支上；豬的S100A4與人、獼猴
8、、黑猩猩和毛猩猩的同源性較高。對(duì)這三個(gè)基因的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，豬的CORONIN1A在N端具有可能的Trp．Asp(WD)repeatssignature，Trp-Asp(WD)repeatsprofileandTrp—Asp(WD)repeatscircularprofile等
