日本榧樹果實中抑制人婦科腫瘤細胞增殖活性成分及其作用機制的研究

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1、河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文日本榧樹果實中抑制人婦科腫瘤細胞增殖活性成分及其作用機制的研究姓名：代麗麗申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師：張紅真；董玫201203中文摘要日本榧樹果實中抑制人婦科腫瘤細胞增殖活性成分及其作用機制的研究摘要目的：日本榧樹(TorreyanllciferL．)是日本、朝鮮和中國特有的一種紅豆杉科植物，其種子有很強的殺蟲活性，在我國和朝鮮用于治療絳蟲感染，在日本民間用作流產(chǎn)藥。關(guān)于日本榧樹的化學(xué)成分研究主要集中在它的葉子和心材上，其根供藥用，具有健胃、利尿、祛痰和驅(qū)蟲等功效。本實

2、驗以人子宮內(nèi)膜癌細胞株(I-mC．1)、人子宮頸癌細胞株(HeLa)、人卵巢囊腺癌細胞株(HAC．2)、人卵巢透明癌細胞株(HOC．21)和人卵巢透明癌細胞株(SHIN．3)為材料，研究日本榧樹果實中純化得到的3種二萜類化合物(18．羥基彌羅松酚、kayadiol和花柏酚)對這5種婦科腫瘤細胞增殖的抑制作用，并以HEC．1細胞為代表，進一步探討kayadiol抑制HEC．1細胞增殖的作用機制?！椒ǎ?MTI'(四甲基偶氮唑藍)LL色法1．1腫瘤細胞株懸液制備’用RPMI．1640完全培養(yǎng)基調(diào)整實驗用腫瘤細

3、胞株濃度為2×105個／mL的細胞懸液備用。1．2體外抑瘤實驗取對數(shù)生長期的實驗用腫瘤細胞，將細胞懸浮接種于96孔板，每孔50此(含1×104個細胞)，分別加入溶劑對照(終濃度O．1％DMSO)、陽性對照(順鉑)和終濃度為1、lO和100¨mol／L的5種二萜類化合物各50止，每組均設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃、5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44h，然后各孔加入5mg／mL的MTT10皿。培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)孔中上清，每孔加入DMSO150止，振蕩10min，充分溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD值)，并計

4、算腫瘤細胞生存率，細胞生存率(％)=(實驗組OD值／對照組OD值)×100％。實驗數(shù)據(jù)用TheSPSSsystemV13．0軟件進行處理，受試藥物對細胞的濃度．效應(yīng)曲線用Hill數(shù)學(xué)模型擬合，計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。中文摘要2凋亡細胞原位標(biāo)記與半定量分析取對數(shù)生長期的HEC．1細胞，將細胞懸浮接種于8孔Chamberslide，每孔100止(含2x104個細胞)，分別加入溶劑對照(終濃度0．1％DMSO)矛I]終濃度為10prnol／L的kayadiol100．此，置于飽和濕度、37℃和5％C

5、02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h和24h。采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測。每張切片拍攝5個陽性視野，分別計數(shù)每視野正常細胞數(shù)和帶有熒光的凋亡細胞數(shù)，以平均陽性細胞所占的正常細胞的百分比作為細胞凋亡率(apoptotierate，AR)。3Westemblotting檢測取對數(shù)生長期的HEC．1細胞，按2x106個細胞／培養(yǎng)皿接種。加入終濃度為10gmol／L的順鉑和kayadiol的培養(yǎng)基，培養(yǎng)細胞48h，離心收集細胞，PBS漂洗細胞，加上樣緩沖液100止，

6、劇烈震蕩后冰浴下超聲波處理1min。100℃加熱10min使蛋白質(zhì)變性，12000r／min離心10min，取上清液測定蛋白濃度。取50嶇蛋白在SDS-PAGE電泳下分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(NC膜)，用5％脫脂奶粉于室溫下?lián)u動封閉膜2h。棄封閉液，用lxTBS．T洗膜3次，每次15min。膜在抗Bax多克隆抗體(1：500)和抗caspase．3多克隆抗體(1：700)稀釋液中室溫過夜孵育，1xTBS．T洗膜3次，每次15min，在二抗稀釋液(抗鼠l：5000)中孵育40min。再次沈膜后加入ECL試劑，

7、反應(yīng)lmin，用X片曝光1．10min后，顯影。4半胱天冬酶抑制劑對kayadiol抑制HEC．1細胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用取對數(shù)生長期的HEC．1細胞，將細胞懸浮接種于96孔板，每孔50此(含lx104個細胞)，分別加入含有半胱天冬酶抑制劑終濃度為l、10和100gmol／Lkayadiol和不含半胱天冬酶抑制劑的kayadiol，各50止，每組均設(shè)3復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44h，各孔加入5mg／mL的MTT10gL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)孔中上清，每孔加入DMSO150此，振蕩10min，充分溶解結(jié)晶，測定O

8、D值，并計算細胞生存率。結(jié)果：lMaT(四甲基偶氮唑藍’)比色法結(jié)果’本實驗采用MTT法探討了3種二萜類化合物(18．羥基彌羅松酚，kayadiol，花柏酚)對5種婦科腫瘤細胞增殖活性的影響。18．羥基彌羅松酚、kayadio和花柏酚對5種婦科腫瘤細胞增值活性有不同的抑制活性。中文摘要其中kayadio對上述5種細胞的增殖顯示強的抑制活性，1、lO和100Ⅳnol／Lkayadio處理的HEC．1細胞，其細胞生存