夾竹桃多糖分離、純化及抗腫瘤活性的研究

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1、福建師范大學碩士學位論文夾竹桃多糖分離、純化及抗腫瘤活性的研究姓名：吳建璋申請學位級別：碩士專業(yè)：發(fā)育生物學指導教師：肖義軍20090601中文摘要目的：本文研究夾竹桃多糖的分離、純化方法，抗腫瘤效果及其作用機制。方法：采用水提醇沉法從夾竹桃葉提取粗多糖(NP)，NP經(jīng)過DEAE-SephadexA-25分級，SephadexG一100純化后得純多糖(NP3、NP4)，分別對其純度和部分理化性質(zhì)進行鑒定。研究NP體內(nèi)對小鼠S180皮下移植瘤和S180腹水瘤生長的抑制作用，采用免疫組化法檢測皮下移植瘤細胞中的PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表達，采用藥物

2、相互作用指數(shù)研究了NP與環(huán)磷酰胺聯(lián)用對S180皮下移植瘤抑制的協(xié)同作用。研究NP對正常小鼠巨噬細胞碳廓清能力、免疫器官指數(shù)和腹腔巨噬細胞吞噬活性的影響，檢測NP對ConA和LPS分別誘導正常小鼠脾臟T、B淋巴細胞的增殖影響。應用MTT法研究純化后的多糖NP3、NP4分別對K562細胞增殖的抑制效果，細胞集落培養(yǎng)觀察NP3、NP4分別對K562中增殖細胞群的影響。結果：經(jīng)提取得到的NP為淡黃色粉末狀物質(zhì)，得率為3．95％，NP的多糖含量為81．14％，NP經(jīng)分離純化后得兩個多糖組分NP3和NP4。NP對小鼠S180移植瘤有明顯的抑制作用并且能顯著延長腹水

3、瘤小鼠的壽命，NP作用后移植瘤組織中表達PCNA、Bcl-2蛋白的細胞陽性率明顯降低，表達Bax蛋白的細胞陽性率明顯升高，NP100mg／kg與CTX10mg／kg組聯(lián)用具有協(xié)同作用。NP能顯著增強正常小鼠巨噬細胞的碳廓清能力，明顯提高胸腺及脾的臟器指數(shù)，顯著增強腹腔巨噬細胞吞噬活性，明顯促進ConA和LPS分別誘導的小鼠脾臟T、B淋巴細胞的增殖能力。NP3、NP4在體外明顯抑制K562細胞增殖。結論：NP體內(nèi)給藥對S180荷瘤小鼠的抑瘤效果顯著，能顯著增強正常小鼠的免疫活性，NP3和NP4在體外均能有效抑制K562細胞增殖。關鍵詞：夾竹桃：多糖；S1

4、80；抑瘤作用；免疫組化；免疫；K562：增殖中文文摘多糖不僅能有效激活免疫細胞的活性、提高機體的免疫能力，而且對宿主正常細胞沒有直接的毒副作用，因此被認為是一種重要的生物效應調(diào)節(jié)劑。近年來，來源于生物材料的多糖作為生物免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)是當今世界的研究熱點。本論文主要研究了夾竹桃(Ne“姍inc／YcumMill．)多糖的提取、分離、純化、部分理化性質(zhì)、抗腫瘤效果及其作用機制。本文的主要工作和研究結果如下：1．經(jīng)過熱水浸提得到的夾竹桃多糖提取液經(jīng)過三氯乙酸法和Sevag法去蛋白、流水透析去除小分子物質(zhì)、乙醇沉淀、離心分離多糖、無水乙醇洗滌、冷凍干燥步驟初步

5、得到夾竹桃粗多糖(NeriumindicumMill．polysaccharides，簡稱為NP)，為淡黃色粉術，得率為3．95％，苯酚一硫酸法測定，提取物中多糖的總糖含量為81．14％。經(jīng)過對預試驗的結果分析后，以DEAE-SephadexA一25為固定相，用0．4mol／LNaCl溶液對NP進行洗脫，收集20管以后改用1．0mol／LNaCl溶液梯度洗脫，流速1mL／min，自動部分收集器收集，每管收集5mL，共收集20管，洗脫液用苯酚一硫酸法跟蹤檢測糖峰出現(xiàn)，得兩個主要級分NPl和NP2。NPI禾INP2分別經(jīng)過SephadexG一100凝膠層析

6、柱進一步純化，均用蒸餾水進行洗脫，流速1mL／min，自動部分收集器收集，每管收集5mL，分別收集20管，洗脫液用苯酚一硫酸法跟蹤檢測糖峰出現(xiàn)，得兩個主要級分NP3矛NNP4。采用苯酚一硫酸反應、硫酸一葸酮反應、茚三酮反應、碘一碘化鉀反應對NP3年DNP4進行了部分理化性質(zhì)的鑒定，結果苯酚一硫酸反應、硫酸一葸酮反應呈陽性，說明兩者均具有多糖的一般性質(zhì)：硫酸一咔唑反應呈陽性，說明兩者均含有糖醛酸；茚三酮反應、碘一碘化鉀反應呈陰性，說明兩者均不含蛋白質(zhì)和淀粉。采用SephadexG-100凝膠柱對NP3和NP4純度進行了鑒定，結果均為單一主峰，說明二者均已

7、經(jīng)達到層析純：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對NP3和NP4純度進行了鑒定，結果兩種多糖在聚丙烯酰胺電泳的分離膠上均呈單一條帶，證明NP3署I]NP4均為分子量均一的多糖，已達到了電泳純。對NP3禾NNP4進行了紫外光譜(UV)分析，UV結果顯示NP3和NP4在260nm矛D280nm處均無吸收峰，說明不含核酸和蛋白質(zhì)。2．根據(jù)藥物的溶解度和預實驗確定了給藥的劑量和梯度。在昆明小鼠右側腋下接種S180腹水瘤，隨機分組，腹腔注射分別給予50、100、150mg／kg的NP，陰性對照組給予等量生理鹽水，陽性對照組給予等量環(huán)磷酰胺(CTX20mg／kg)，觀察NP

8、IV中文文摘對小鼠S180實體瘤生長的抑制作用。結果顯示，NP的50、100、150mg／l(