凡納濱對蝦胚胎發(fā)育的時序及特征研究

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1、凡納濱對蝦胚胎發(fā)育的時序及特征研究0、引言【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）又名南美白對蝦，是迄今世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的優(yōu)良蝦種，因其具有殼薄體肥、肉質(zhì)鮮嫩、生長迅速、群體生長均勻、抗病力強等優(yōu)點，深受國內(nèi)外市場的青睞（林瓊武等，2006；Aloiseetal.，2011；彭金霞等，2013）。開展繁殖生物學(xué)研究、完善苗種培育技術(shù)及制定人工育苗標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)范，是實現(xiàn)凡納濱對蝦人工規(guī)?；庇挠行緩剑欢_立不同溫度下受精卵第一、第二極體釋放時間，是開展凡納濱對蝦雌核發(fā)育誘導(dǎo)及后續(xù)細(xì)胞工程育種研究的

2、重要基礎(chǔ)。因此，有必要深入開展凡納濱對蝦的胚胎發(fā)育生物學(xué)研究?！厩叭搜芯窟M展】隨著國內(nèi)外對蝦增養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，以提升養(yǎng)殖產(chǎn)量和品質(zhì)為主要目標(biāo)的染色體組工程已成為對蝦育種研究的重點領(lǐng)域（Garnica-Riveraetal.，2004；Sellarsetal.，2010；Aloiseetal.，2011）。目前，有關(guān)對蝦胚胎及幼體發(fā)育的研究集中在形態(tài)描述（García-guerreroandHendrickx，2009；栗治國等，2013），且發(fā)現(xiàn)水溫變化是對蝦繁殖和生長發(fā)育的關(guān)鍵因素（彭昌迪等，2002），在生長、存活、

3、生理生化和能量代謝等方面均已得到證實（ChenandLai，1993；Wybanetal.，1995；Kumluetal.，1995；李庭古等，2006）。國內(nèi)已有學(xué)者對紅螯螯蝦、凡納濱對蝦、克氏原螯蝦和脊尾白蝦等的胚胎發(fā)育過程進行了觀察和描述（孟凡麗等，2000；彭昌迪等，2002；呂建林等，2006；栗治國等，2013）；國外學(xué)者則主要針對羅氏沼蝦和長臂蝦科4種對蝦的胚胎發(fā)育進程及發(fā)育形態(tài)特征進行觀察（Mülleretal.，2004；García-guerreroandHendrickx，2009）。有關(guān)對蝦雌核發(fā)育

4、的研究國內(nèi)外鮮見報道，僅見國內(nèi)學(xué)者在20世紀(jì)90年代進行了一些試驗性嘗試（戴繼勛等，1993；蔡難兒等，1995；陳本楠等，1997），但至今未獲得對蝦雌核發(fā)育誘導(dǎo)技術(shù)的突破?！颈狙芯壳腥朦c】凡納濱對蝦卵子染色體加倍是雌核發(fā)育誘導(dǎo)的兩大技術(shù)之一，而受精卵極體釋放時間又是染色體加倍成功與否的關(guān)鍵，目前在國外雖有相關(guān)研究報道（Garnica-Riveraetal.，2004；Aloiseetal.，2011），但因品種和環(huán)境條件差異而尚無定論。【擬解決的關(guān)鍵問題】以廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院選育獲得并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的國審水產(chǎn)新品種（

5、登記號GS-01-001-2012）———凡納濱對蝦“桂海1號”為研究對象，對該品種不同溫度下受精卵發(fā)育時序進行觀察，旨在了解凡納濱對蝦胚胎發(fā)育的時序及特征，尤其是第一極體和第二極體排出的時間點，為其雌核發(fā)育誘導(dǎo)中染色體加倍最佳操作窗口的確定及人工苗種生產(chǎn)提供參考依據(jù)。1、材料與方法1.1親本來源及孵化用水處理雌雄親蝦為廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院國家級SPF南美白對蝦良種場車間內(nèi)人工培育至性腺成熟的桂海1號，其中，雌蝦體重60.47〒1.79g，體長20.27〒0.64cm；雄蝦體重44.13〒2.02g，體長18.00〒0.53

6、cm。自然海水經(jīng)暗沉淀、砂濾，雙層棉濾袋過濾兩次后再用濾器過濾3次，并以甲醛和優(yōu)樂碘分別殺菌，EDTA鈉鹽螯合重金屬離子（彭昌迪等，2002）。1.2胚胎發(fā)育觀察從雌蝦池中挑選已成功交配貼莢的雌蝦（背部暗紅色性腺線條連續(xù)且清晰），臵于500L的玻璃圓桶內(nèi)待產(chǎn)卵，水溫控制在（30.0〒0.5）℃，鹽度28.6‰，避光，不充氣，產(chǎn)卵后移走親蝦，并及時采集受精卵進行連續(xù)顯微觀察。具體操作：先在直徑4cm的細(xì)胞培養(yǎng)級平皿中用微吸管或槍頭吸取1滴經(jīng)凈化消毒滅菌的海水（20.0μL），保持液滴在平皿中不擴散，呈球形液滴，然后吸取細(xì)胞培

7、養(yǎng)級礦物油將該海水液滴完全覆蓋，使海水液滴完全包裹于礦物油中，防止揮發(fā)擴散。在解剖鏡或光學(xué)顯微鏡下，用玻璃毛細(xì)管小心挑選吸出3枚正常的受精卵，將其小心移入海水液滴中，隨后調(diào)整物鏡，并設(shè)臵拍照時間進行連續(xù)拍照，中途無需添加海水，但需定時觀察確認(rèn)顯微鏡物鏡鏡頭是否正位，如移位則進行微調(diào)（孟凡麗等，2000）。1.3不同水溫下的受精卵孵化試驗將成功交配的雌蝦每尾單獨臵于室內(nèi)500L的玻璃圓桶內(nèi)，水溫控制在（30.0〒0.5）℃，促其產(chǎn)卵，試驗用水為凈化處理的潔凈海水，鹽度26.0‰~29.0‰，pH8.1~8.5。當(dāng)觀察到雌蝦產(chǎn)

8、卵后，從桶內(nèi)隨機收集50枚受精卵，分別轉(zhuǎn)入以水浴控溫在28.0、29.0、29.5、30.0和30.5℃的500mL玻璃燒杯中孵化，每個溫度梯度重復(fù)3次。期間定時輕輕攪動水體，使卵子均勻懸浮分布，觀察不同水溫梯度受精卵的孵化情況（彭昌迪等，2002；林瓊武等，2006）。1.4統(tǒng)計分析以Excel200