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1、分類號：Q71密級：UDC：577學號：2111501010碩士學位論文馬氏珠母貝棱柱層相關基質蛋白基因的克隆及功能研究范閃閃指導教師：杜曉東教授申請學位類別：理學碩士專業(yè)名稱：海洋生物學研究方向：海產經濟動物發(fā)育生物學學院名稱：水產學院中國·湛江2018年6月馬氏珠母貝棱柱層相關基質蛋白基因的克隆與功能研究摘要貝殼基質蛋白(ShellMatrixProteins,SMPs)是貝殼形成的主要參與者和功能執(zhí)行者，在有機框架構建和礦物沉積過發(fā)揮重要作用。本課題組前期通過對馬氏珠母貝(Pinctadafucatam
2、artensii)貝殼基質蛋白質組分析，獲得了棱柱層SMPs。本研究對其中的5個SMPs基因進行全長克隆，并通過qRT-PCR、原位雜交(ISH)、RNAi和原核表達技術進行功能驗證。結果如下：1、β-N-乙酰-己糖胺酶(Beta-hexosaminidase/Beta-N-acetylhexosaminidase,HEX)屬于糖苷水解酶20家族(GH20)，是幾丁質代謝的關鍵水解酶。幾丁質作為有機框架主要成分，其代謝在貝殼礦化中發(fā)揮重要作用。本研究克隆獲得2個β-N-乙酰-己糖胺酶基因PmHEX和PmHEX
3、L。PmHEX全長3813bp，編碼1141個氨基酸；PmHEXL全長2760bp，編碼774個氨基酸；二者均含有兩個典型的GH20和GH20b結構域和一個碳水化合物結合結構域(CHB-HEX)。QRT-PCR分析表明PmHEX和PmHEXL在外套膜邊緣區(qū)(ME)和套膜區(qū)(MP)均顯著高表達，ISH檢測顯示PmHEX和PmHEXL均主要定位于邊緣區(qū)外褶和套膜區(qū)的外側上皮細胞。RNAi干擾后，PmHEX在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)的表達量均顯著下調(P<0.05)；且貝殼棱柱層和珍珠層微觀結構都出現(xiàn)不同程度的紊亂。因
4、此，PmHEX參與了貝殼棱柱層和珍珠層的形成。2、幾丁質結合蛋白在與幾丁質特異性結合、鈣化調控等過程發(fā)揮重要作用。通過克隆獲得馬氏珠母貝幾丁質結合蛋白(Chitinbindingprotein,CBP)PmCBP基因全長序列6367bp，編碼2044個氨基酸，包含20個典型的ChtBD2結構域(CBDs)，且ChtBD2結構域在物種間具有較高的保守性。QRT-PCR分析表明PmCBP在外套膜套膜區(qū)表達量最高(P<0.05)；ISH分析顯示PmCBP基因主要分布于外套膜套膜區(qū)外側上皮細胞。RNAi干擾后，PmC
5、BP在外套膜套膜區(qū)的表達量顯著下調，且貝殼珍珠層結構生長紊亂。相關性分析發(fā)現(xiàn)PmCBP的表達水平與殼重和殼長呈正相關(P<0.05)。因此，PmCBP參與了貝殼珍珠層的形成。3、本研究克隆獲得馬氏珠母貝含表皮生長因子樣結構域的蛋白(Epidermalgrowthfactor-likedomain-containingprotein,EGFCP)PmEGFCP(PU12)基因全長1394bp，編碼363個氨基酸，具有2個保守的表皮生長因子樣結構域(Epidermalgrowthfactor-likedomain
6、,EGF)、一個透明帶結構域(Zonapellucidadomain,ZP)。QRT-PCR分析表明PmEGFCP在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)著高表達(P<0.05)；ISH檢測顯示PmEGFCP主要定位于邊緣區(qū)外褶外側和中褶內側以及套膜區(qū)外側上皮細胞。RNAi干擾后IPmEGFCP在邊緣區(qū)的表達量顯著下調，且貝殼棱柱層結構生長紊亂，珍珠層正常。因此，PmEGFCP參與了貝殼棱柱層的形成。通過構建pET32a-PmEGFCP的原核表達載體，成功誘導表達了PmEGFCP重組蛋白，Westernblot檢測其帶有His
7、標簽，且與預測分子量大小一致。經復性濃縮凍干獲得3mg的PmEGFCP重組蛋白。4、本研究克隆獲得馬氏珠母貝沒有功能注釋的殼基質蛋白基因Pm-PNU7全長序列797bp，編碼145個氨基酸，具有特殊的“KGG”重復序列和富含天冬氨酸(Asp)序列“DDDDDDHDD”。QRT-PCR分析表明Pm-PNU7基因在外套膜邊緣區(qū)和套膜區(qū)顯著高表達(P<0.05)；ISH檢測顯示Pm-PNU7主要定位于邊緣區(qū)外褶外側和內側上皮細胞、中褶內側上皮細胞以及套膜區(qū)外側上皮細胞。RNAi干擾后，Pm-PNU7在外套膜邊緣區(qū)和
8、套膜區(qū)的表達量均顯著下調，貝殼棱柱層和珍珠層微觀結構均出現(xiàn)不同程度的紊亂。因此，Pm-PNU7參與了貝殼棱柱層和珍珠層的形成。關鍵詞：馬氏珠母貝；棱柱層；貝殼基質蛋白；RNAi；原核表達IICloningandFunctionalStudyofShellMatrixProteinGenesRelatedtoPrismaticLayerFormationinPinctadafucatamartensi
