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1、學校代碼：10264研究生學號：M150101015上海海洋大學碩士學位論文紅毛菜科紅藻的遺傳育種題目：與功能基因研究Studyongeneticbreedingand英文題目：functionalgeneinBangiaceae專業(yè)：水產養(yǎng)殖研究方向：藻類遺傳育種姓名：曹原指導教師：汪文俊副研究員二O一八年五月上海海洋大學碩士學位論文上海海洋大學碩士學位論文上海海洋大學碩士學位論文紅毛菜科紅藻的遺傳育種與功能基因研究摘要海藻營養(yǎng)豐富，味道鮮美，且在制藥、工業(yè)等領域都有廣泛應用，因此市場對于海藻的需求不
2、斷增加。這一現(xiàn)象使我國海藻養(yǎng)殖業(yè)正在經歷從穩(wěn)步增長到快速增長的轉變，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖技術也在不斷優(yōu)化更新，養(yǎng)殖品種更加多元化，條斑紫菜（Pyropiayezoensis）、壇紫菜（Pyropiahaitanensis）紅毛菜（Bangia）、海帶（SaccharinaJaponica）、羊棲菜（Hizikiafusifarme）等。本研究以同屬紅毛菜科紅藻的條斑紫菜和紅毛菜為實驗材料，通過分子克隆和標記以及低鹽脅迫的方法，針對隨著海藻養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展而出現(xiàn)的一些問題進行了探究，以期為豐富北方海藻種質資
3、源和更深入地了解其抗逆性生理生化響應提供依據(jù)。實驗結果表明：以條斑紫菜優(yōu)質品系為對照，不同海區(qū)栽培的“黃優(yōu)1號”品系與野生親本在各生化組分（藻膽蛋白、葉綠素a、類胡蘿卜素和可溶性蛋白）含量上有明顯差異?！包S優(yōu)1號”在不同海區(qū)栽培藻體的藻膽蛋白含量均高于其親本“野生群體1”，其中于日照海區(qū)培育的品系1b的各類藻膽蛋白的含量最高，呈顯著性差異（p<0.05），而相較于作為同海區(qū)優(yōu)質條斑紫菜“對照品系”略低，但差異不顯著（p>0.05）。而對于葉綠素a（Chla）和類胡蘿卜素（Car）含量來說，“黃優(yōu)1號”中
4、來自日照的培育品系1b的各物質含量皆顯著高于其親本和其它培育品系以及來自同海區(qū)的優(yōu)質條斑紫菜（p<0.05）。對于可溶性蛋白（TSPs）來說，雖分為兩個子集，但日照培育的“黃優(yōu)1號”含量仍然最高，但與對照和野生2品系差異不顯著（p>0.05）。而同在南通海域栽培的“黃優(yōu)1號”和培育品系2的各物質含量相差不大。以上結果說明，從野生群體中用合適的選育手段培育品質更佳的栽培品系（群體）具有可行性。而不同海區(qū)對“黃優(yōu)1號”栽培藻體的品質有很大影響，其中于日照進行栽培的“黃優(yōu)1號”藻體品質最佳。我們推測，來自北方
5、的紫菜種質不適于生長在溫度相差較大的南方海域，而日照海區(qū)的環(huán)境條件更適合“黃優(yōu)1號”的生長。為做進一步了解，選用rbcL和COⅠ基因特異性擴增和AFLP分子標記技術對“黃優(yōu)1號”條斑紫菜的遺傳多樣性進行了探究。基因擴增結果表明，基于rbcLI上海海洋大學碩士學位論文序列（約1200bp）僅砣磯島養(yǎng)殖繩上全沉水生長的野生紫菜群體與其他品系（群體）具有1.1%的遺傳差異，COⅠ序列（680bp）也僅南通栽培的兩個品系出現(xiàn)兩個堿基的變異，其他品系（群體）與對照條斑紫菜序列完全一致。而AFLP分子標記結果用7對
6、引物擴增出了249條清晰條帶，其有248條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分比高達99.6%。遺傳多樣性分析顯示，兩個野生群體Wild1、2的多態(tài)性最高，分別為47.39%和59.44%；三代“黃優(yōu)1號”及兩個對照組的多態(tài)性均在區(qū)間[20.08%，24.50%]內。聚類分析結果表明，大部分群體間遺傳距離較為相近，多介于[0.0181,0.0758]內，而同為“黃優(yōu)1號”的嶗山栽培群體HYF2L和對照群體Control2與其它群體間的遺傳距離較遠，多介于[0.1325,0.2527]內，分析得到各群體間的遺傳距離與
7、養(yǎng)殖方式有關。由于同為全沉水生活方式的群體間遺傳距離也相隔較遠，我們推測：全沉水生活方式在條斑紫菜遺傳多樣性上起到了關鍵性的作用。用RACE方法成功克隆了質膜H+-ATPase基因PMHA1，5’-RACE與3’-RACE各獲得一條明亮的特異性條帶，長度分別為1000bp和1800bp。拼接后，獲得全長為3368bp的PMHA1基因cDNA，含有一個3129bp長的開放閱讀框，編碼1042個氨基酸，分子量為106.51kD。綜合其理化性質分析，預測的蛋白共包含29個α螺旋和35個β折疊以及19個蛋白激酶
8、C、1個糖基化位點和3個氨基化位點以及77個磷酸化位點且分布復雜。我們將紅毛菜的PMHA1蛋白與其他13個物種同源蛋白進行了比較分析，結果顯示物種之間有一定的相似性,但紅毛菜質膜H+-ATPase基因的差異較大。綜合上述結果，我們推測較多的磷酸化位點會讓紅毛菜藻體受到外界脅迫刺激后，該蛋白的活性迅速提高，靈敏度高。其具有P型H+-ATPase家族的特征序列和保守結構域，但未發(fā)現(xiàn)與之匹配度高的同源序列。為了了解PMHA1的表達特征，應用實時熒
