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1、雞尸加zZJ啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的初步研究PreliminaryIdentifyingregulatoryelementsinthePromotorofChickenPiwill本研究由國家自然科學(xué)基金(31372297)(31301966)；國家科技部支撐計(jì)劃(2011BAD28803)資助SupportedbyNationalNaturalScienceFoundation(GrantNo．31372297)(GrantNo．31301966)，NationalScientific&TechnologyPillarProgram(G
2、rantNo．201BAD28803)雞PiwUl啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的初步研究研究生：夏明秀導(dǎo)師：陳國宏教授常國斌教授專業(yè)：特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物與飼養(yǎng)中文摘要PIWI(P．element．inducedwimpytestis)是Argonatute家族的一個(gè)分支，主要存在于生殖細(xì)胞中，對(duì)生殖干細(xì)胞的維持和精子的發(fā)生起著重要的作用。自PIWI在果蠅中發(fā)現(xiàn)以來，在小鼠、人等哺乳動(dòng)物中相繼獲得證實(shí)，其功能研究也隨之深入，但有關(guān)家禽PIWI功能的研究甚少。前期研究發(fā)現(xiàn)Piwill的轉(zhuǎn)錄存在時(shí)空差異，為探討其在家禽中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究以狼山雞為實(shí)驗(yàn)
3、動(dòng)物，根據(jù)Piwill啟動(dòng)子序列，將Piwill啟動(dòng)子系列缺失片段插入到pGL3．basic載體，構(gòu)建系列缺失載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS．7和GC．1細(xì)胞系，最后通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)確定Piwill核心啟動(dòng)子區(qū)；針對(duì)核心啟動(dòng)子區(qū)，預(yù)測(cè)可能存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變，并構(gòu)建突變重組質(zhì)粒，通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步確定存在的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的調(diào)控作用。提取狼山雞睪丸組織核蛋白進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)，確定轉(zhuǎn)錄因子與Piwill的結(jié)合。分離狼山雞PGCs、SSCs、精原細(xì)胞，并用秋水仙素處理精原細(xì)胞，對(duì)四種細(xì)胞提取核蛋白并進(jìn)行凝
4、膠遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：1．根據(jù)Piwill啟動(dòng)子序列，成功構(gòu)建了7個(gè)系列缺失載體，系列缺失表達(dá)載體雙熒光素酶報(bào)告基因顯示：M1．M5系列缺失表達(dá)載體在COS．7和GC．1細(xì)胞系中都有表達(dá)，其中M4系列缺失表達(dá)載體在兩細(xì)胞系中相對(duì)熒光素酶活性最高；M6．M7系列缺失表達(dá)載體在兩個(gè)細(xì)胞系中基本沒有表達(dá)；從而表明：．268"-'221區(qū)域是Piwill核心啟動(dòng)子區(qū)。2．在確定核心啟動(dòng)子基礎(chǔ)之上，對(duì)核心啟動(dòng)子區(qū)可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，成功構(gòu)建了突變重組質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告基因顯示：未突變重組質(zhì)粒與突變重組質(zhì)粒在COS．7細(xì)胞系和
5、GC．1細(xì)胞系中都進(jìn)行了表達(dá)，且前者相對(duì)熒光素酶活性明顯高于后者，這表明：在此區(qū)域內(nèi)，存在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并且對(duì)啟動(dòng)子的活性起著重要的調(diào)控作用。3．EMSA實(shí)驗(yàn)表明：成功設(shè)計(jì)并標(biāo)記了探針；凝膠遷移結(jié)果表明：轉(zhuǎn)錄因子與該DNA序列能夠結(jié)合；經(jīng)超凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明：睪丸組織中確實(shí)存在轉(zhuǎn)錄因子NF．Y，并可以與目的DNA片段特異性結(jié)合。4．分離雞的原始生殖細(xì)胞(PGCs)，精原干細(xì)胞(SSCs)，精原細(xì)胞；用秋水仙素處理精原細(xì)胞，四種細(xì)胞凝膠遷移實(shí)驗(yàn)顯示：在四種細(xì)胞中都存在轉(zhuǎn)錄因子NF．Y，并與Piwill啟動(dòng)子．239／．221區(qū)DN
6、A序列結(jié)合。積分光度值表明：NF．Y在秋水仙素誘導(dǎo)的精原細(xì)胞中較高，其次為精原細(xì)胞，SSCs，最后為PGCs。我們推測(cè)tPiwill存在家禽的整個(gè)精子發(fā)生過程中，且在精原細(xì)胞向精母細(xì)胞的分化過程中起著重要的調(diào)控作用。關(guān)鍵字：雞；Piwill；啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；EMSAPreliminaryIdentifyingregulatoryelementsinthePromotorofchickenlllCPiwill，nI，ZZ』Master：MingxiuXiaSupervisor：Prof．GuohongChenProf．GuobinCha
7、ngMajor：TheRearingofSpecial-typeEconomicAnimalsABSTRACTPIWI(P·-element·-inducedwimpytestis)isabranchoftheArgonatutefamilymainlyexistedingermlines，andplaysanimportantroleingermlinestemcellmaintenanceandspermatogenesis．SincePIWIhasbeenfirstdiscoveredinDrosophila,itsubseque
8、ntlyfoundinmouse，humanandotheranimals，butrelatedstudiesonpoultryhasbeenrarelyreported．Previousstudiesha
