羅伯茨綠僵菌中g(shù)蛋白偶聯(lián)受體基因的敲除及功能分析

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1、０３６４分類號(hào)：?jiǎn)挝淮a；１；學(xué)號(hào)；密級(jí)會(huì)後；ｌ＾ｉｌｒ乂ｆ學(xué)位論文羅伯茨綠僵菌中Ｇ蛋白偶聯(lián)受體基因的敲除及功能分析ＴｈｅＫｎｏｃｋｏｕｔａｎｄＡｎａｌｓｉｓ化ｅＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆＧＰｒｏｔｅｉｎＣｏｕｌｅｄｙｐａｃｃｅｐｔｏｒｓｉ社Ｍ別ｃｉｒｈｉｚｉｕｍｒｏｂｂｅ巧《Ｕ研究生：周榮指導(dǎo)教?zhēng)煟海夵S勃教授合作指導(dǎo)教師：申請(qǐng)學(xué)位口類級(jí)別：農(nóng)學(xué)碩±專業(yè)名稱；園林植物與觀賞園藝研究方向；真菌分子生槪學(xué)

2、所在學(xué)院：棘學(xué)與園林學(xué)院答般員會(huì)主席；２０１５年１１月＇／ｆ獨(dú)創(chuàng)性聲明本乂聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)斤的研巧工作及取得的研巧成示注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)果，除了文中特則加則。盡我所知表或撰寫過(guò)的研巧成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書一而使用過(guò)的材料。與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。辦＇／曰：年ｎ月研巧生簽名；時(shí)間文占—同爭(zhēng)．關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人

3、完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，目Ｐ；學(xué)校有權(quán)保留印、印或等復(fù)和，臥用縮掃描查借閱可采影送交論文的復(fù)巧件和磁盤，允許論文被閱上、用不同方不同媒體發(fā)表。意業(yè)大學(xué)可式在段保存、匯學(xué)位論同安徽農(nóng)制編文手全部。傳的或部分內(nèi)容播學(xué)位論文此協(xié)議保后應(yīng)遵守密的學(xué)位論文在解密）（—－０／／間：之年／日間月Ｔ研生簽：時(shí)。Ｊ名究ｆ＾一／：＂日月簽；時(shí)間年名ｊ第導(dǎo)師摘要昆蟲病原真菌綠僵菌（Materhizium）作為殺蟲資源的種類之一，不僅具備真菌殺蟲劑的所有優(yōu)點(diǎn)，還具有安全、制劑易

4、生產(chǎn)、貨架期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛研究。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前全世界超過(guò)200種農(nóng)林害蟲能被綠僵菌制劑寄生致死。然而，綠僵菌同其他微生物體農(nóng)藥一樣，也存在一些不足，例如昆蟲致死時(shí)間長(zhǎng)，殺蟲效率較低，防效不穩(wěn)定等，嚴(yán)重限制其大規(guī)模應(yīng)用。因此，系統(tǒng)深入理解昆蟲病原真菌致病的機(jī)制，可為高效殺蟲菌株的選育提供理論依據(jù)。G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是一類非常重要的信號(hào)分子受體,是真核生物中最大的一類跨膜蛋白家族。G蛋白偶聯(lián)受體在胞外信號(hào)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中起到重要的作用,調(diào)節(jié)控制著細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)。可以說(shuō)GPCRs調(diào)控著

5、幾乎所有已知的生理過(guò)程,例如激素、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、氣味和光等介導(dǎo)的生理行為等都有G蛋白偶聯(lián)受體的參與。所以說(shuō)，在生物體中，G蛋白偶聯(lián)受體有著不容忽視的重要作用。絲狀真菌雖然作為真核生物中最低等的部分，但是它們確是對(duì)人類生命活動(dòng)的各個(gè)方面產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，所以為了控制絲狀真菌對(duì)人類不利的一面，充分利用其有益的特性服務(wù)于人類，就必須深入的了解其生理、遺傳以及分子生物學(xué)方面的信息,并通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行有效改造。近年來(lái)有很多絲狀真菌的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成或正在進(jìn)行即將完成，于是乎對(duì)具體基因功能的研究就無(wú)可避免的

6、成為了絲狀真菌研究的一個(gè)熱點(diǎn)，而這其中利用反向遺傳學(xué)的方法來(lái)敲除基因是研究絲狀真菌功能基因的常用方法之一。在對(duì)野生型羅伯茨綠僵菌(Mr23)孢子懸浮液進(jìn)行40℃的水浴熱激，并對(duì)熱激后所形成的的表達(dá)譜的分析中，結(jié)果顯示G蛋白偶聯(lián)受體的基因表達(dá)是明顯上調(diào)的，所以我們可以推測(cè)得知在綠僵菌的抗逆境過(guò)程中，G蛋白偶聯(lián)受體起著很重要的作用。于是本文采取用結(jié)合基因敲除技術(shù)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)來(lái)完成對(duì)野生型羅伯茨綠僵菌（MetarhiziumrobberstiiARSEF23）體內(nèi)G蛋白偶聯(lián)受體的基因功能的預(yù)測(cè)。首先查找出GP

7、CRs在基因組中的位置，并找到其上游及下游序列，構(gòu)建敲除的載體，通過(guò)將敲除載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌AGL-1中，獲得含有敲除質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株，將農(nóng)桿菌菌株與野生型羅伯茨綠僵菌（Mr23）共培養(yǎng)，篩選出陽(yáng)性菌株，即獲得了綠僵菌的敲除株，用同樣的方法構(gòu)建回補(bǔ)突變的農(nóng)桿菌菌株，用其與綠僵菌敲除株共培養(yǎng)，獲得綠僵菌回補(bǔ)菌株。將野生型羅伯茨綠僵菌菌株（Mr23），敲除菌株(△MrGPCR)和回補(bǔ)突變菌株(△MrGPCR::MrGPCR)進(jìn)行相應(yīng)的生物學(xué)特性的測(cè)定，抗逆性能的測(cè)定和相應(yīng)毒力能力的測(cè)定，觀察比較，得出結(jié)論。從目前的狀

8、況看來(lái)，在真菌中GPCRs的應(yīng)用還是有限的，所以，在綠僵菌中研究GPCRs還是很有前景與價(jià)值的。所以本文采用用基因敲除技術(shù)與農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)來(lái)研究GPCRs在綠僵菌體內(nèi)的功能是具有一定的理論意義與實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值的，創(chuàng)新性很明顯。主要的研究結(jié)果結(jié)論如下：1.在NCBI中查找出G蛋白偶聯(lián)受體的序列，并找到在基因組中的位置，并且成功的構(gòu)建了敲除質(zhì)粒和回補(bǔ)質(zhì)粒，