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1、分類號：S855.3單位代碼：10193密級：公開學號：2012613碩士學位論文藍舌病病毒VP7蛋白、施馬倫貝格病毒N蛋白的原核表達及間接ELISA檢測方法的建立ProkaryoticExpressionofBluetongueVirusVP7Protein,SchmallenbergVirusNProteinandDevelopmentofIndirectELISA作者姓名：王貞鈞學位類別：農(nóng)學碩士專業(yè)名稱：臨床獸醫(yī)學研究方向：現(xiàn)代獸醫(yī)臨床診療新技術(shù)指導教師：王全凱教授賈赟高級獸醫(yī)師所在學院：動物科學技術(shù)學院20
2、15年5月獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文是本人在導師指導下，獨立進行研究所取得的成果。盡我所知，除文中特別加以標注和致謝所列內(nèi)容外，論文中不包含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得吉林農(nóng)業(yè)大學或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。本學位論文所有內(nèi)容若有不實之處，本人愿意承擔一切相關(guān)法律責任和后果。學位論文作者簽名：簽字日期：年月日關(guān)于學位論文使用授權(quán)的聲明1、本人完全了解吉林農(nóng)業(yè)大學有關(guān)保留和使用學位論文
3、的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學位期間所完成的論文及相關(guān)成果的知識產(chǎn)權(quán)屬吉林農(nóng)業(yè)大學所有，并同意將本論文的版權(quán)授權(quán)給吉林農(nóng)業(yè)大學，學校有權(quán)保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。2、本人（同意/不同意，務必打印后填寫）吉林農(nóng)業(yè)大學將本論文版權(quán)授權(quán)給不同媒體進行電子出版、多媒體出版、網(wǎng)絡出版以及其他形式出版（涉密學位論文解密后應遵守此協(xié)議）。3、本人聲明畢業(yè)后若發(fā)表在攻讀研究生學位期間完成的論文及相關(guān)的學術(shù)成果，必須以吉林農(nóng)業(yè)大學作為第一署名單位。學位論文作者
4、簽名：簽字日期：年月日指導教師簽名：簽字日期：年月日摘要藍舌?。˙luetongue，BT）是由藍舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV）引起的一種烈性非接觸性傳染病。BTV屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬(Obivirus)藍舌病病毒亞群，主要侵害純種細毛羊。該病毒是由10個片段組成的雙股RNA病毒，共編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1~VP7）和5種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3、NS3a、NS4）。其中VP7蛋白攜帶群特異性抗原決定簇，至少含有6個線性抗原表位，通過對不同血清型VP7蛋白的
5、氨基酸序列比對得出，30~48位氨基酸殘基的序列同源性為100%，證明VP7蛋白為高度保守的蛋白，具有群特異性，是BTV抗體檢測的理想抗原。施馬倫貝格病是由施馬倫貝格病毒（Schmallenbergvirus，SBV）引起的經(jīng)庫蠓傳播的一種新型病毒性傳染病。SBV是由3個片段組成的單股負鏈RNA，屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）辛波血清群病毒（Simbuserogroupviruses），此病蔓延于西歐大部分地區(qū)，我國目前尚未出現(xiàn)此病。在施馬倫貝格病毒編碼的
6、蛋白中，核衣殼N蛋白抗原性最強，因此N蛋白成為研究熱點。本研究為了建立BTV-VP7ELISA檢測方法，根據(jù)GenBank中BTV25型毒株的VP7基因序列（登錄號EU839843.1）設計一對引物，以含VP7基因的重組質(zhì)粒為模板，利用PCR方法擴增出BTV25型毒株的VP7目的基因，克隆至pET-24b(+)表達載體中，獲得pET-24b-BTV-VP7重組質(zhì)粒。經(jīng)核苷酸序列測定，將正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達純化His-BTV-VP7蛋白，以此蛋白作為包被抗原建立間接ELIS
7、A檢測方法。經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定表明，VP7蛋白以包涵體形式表達，分子量大小與預期相符。ELISA優(yōu)化結(jié)果表明，抗原80倍稀釋、山羊陽性血清400倍稀釋、HRP標記的驢抗山羊IgG5000倍稀釋為最佳稀釋度。利用該方法與IDEXX藍舌病毒VP7抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果對比，二者一致性超過94%；檢測其他4種病毒陽性血清，結(jié)果均為陰性。說明建立的此法敏感性高、特異性強可以用于藍舌病的流行病學調(diào)查，且成本低。由于施馬倫貝格病毒是外來病毒，我國尚未出現(xiàn)此病毒株，也沒有出現(xiàn)感染病例，所以本研究為了建
8、立SBV-NELISA檢測方法，根據(jù)GenBank公布的SBV（BH80/11-4）堿基序列，利用基因合成的方法獲得SBV-N蛋白的基因，克隆至pET-24b(+)表達載體中，獲得pET-24b-SBV-N重組質(zhì)粒。經(jīng)核苷酸序列測定，將正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達純化His-SBV-NI蛋白。經(jīng)SDS-PA
