bvdv重組e2蛋白間接elisa檢測方法的建立及初步應(yīng)用

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1、摘要牛病毒性腹瀉/粘膜?。˙ovineviraldiarrhea/mucosaldisease,BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovineviraldiarrhoeavirus，BVDV）引起的，表現(xiàn)為腹瀉、繁殖障礙、免疫抑制、持續(xù)性感染和嚴(yán)重的黏膜病等癥狀。該病主要傳染牛，犢牛最為易感，也可感染其他反芻獸和人。與其他瘟病毒屬成員有血清交叉反應(yīng)，給診斷和疫苗免疫帶來了極大困難，對我國養(yǎng)牛業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。目前，我國BVDV暫無有效疫苗，因此建立一種快速有效的診斷方法尤為重要。E2蛋白是BVDV的免疫囊膜蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，可以作為BVD診斷蛋白。本研究利用昆蟲細(xì)胞真核表達(dá)系

2、統(tǒng)成功表達(dá)E2蛋白并純化，經(jīng)間接免疫熒光和Westernblot鑒定，測定蛋白濃度為360μg/mL。以純化后的E2蛋白為包被抗原，以BVDV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清為陰、陽性對照，建立了BVDV抗體間接ELISA檢測方法。經(jīng)過選擇和優(yōu)化，確定蛋白抗原最佳包被濃度為6μg/mL，最佳血清稀釋倍數(shù)為1：80，最佳包被液選擇碳酸鹽緩沖液，最佳封閉液選擇5%脫脂乳，最佳血清最適作用時間為60min，最佳酶標(biāo)二抗工作濃度為1：10000，最佳底物作用時間為15min。與國外商品化試劑盒比較，總符合率為91.5%。因此，本文建立的BVDVE2抗體間接ELISA診斷方法可以作為BVDV的檢測方法。為了了解黑龍江

3、地區(qū)奶牛BVD的流行情況，使用建立的BVDV抗體間接ELISA檢測方法，對2012~2014年間黑龍江部分地區(qū)1485份奶牛血清進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果顯示，這3年的BVDV抗體陽性率分別為59.63%、61.70%、70.33%，且三年間的BVDV抗體總陽性率為64.10%，呈逐年上升趨勢。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，黑龍江地區(qū)奶牛BVD流行情況存在西部地區(qū)高于東部地區(qū)，發(fā)病季節(jié)無明顯差異，規(guī)?；B(yǎng)殖場高于散養(yǎng)戶的特點(diǎn)。關(guān)鍵詞：牛病毒性腹瀉病毒；E2蛋白；真核表達(dá)；間接ELISA；血清流行病學(xué)IAbstractBovineviraldiarrhea/mucosaldisease(BVD/MD)iscaus

4、edbyinfectionofcattlewithbovineviraldiarrheavirus(BVDV).BVDVcancauseDiarrhea,reproductivedisorders,immunesuppression,persistentinfectionandseveremucosaldisease.Thediseasemainlyinfectedcattle,especiallycalves,canalsoinfectotherruminantanimalsandhumenbeings.BVDVhasserologicalcross-reactionswithotherm

5、embersofpestiviruses,itcausedgreatdifficultiesfordiseasediagnosisandvaccine,andhasaseriousimpactonchinesecattleindustry.Atpresent,thereisnovaccineagainstBVDV.Thereforetheestablishmentofafastandeffectivemethodofdiagnosisisparticularlyimportant.BVDVE2proteinisanimmuneenvelopeprotein,asdiagnosticprote

6、in,canstimulatetheproductionofneutralizingantibodies.asBVDdiagnosticprotein.Inthisstudy,theE2proteinwassuccessfullyexpressedandpurifiedbyinsectcellseukaryoticexpressionsystems.Proteinconcentrationwas360μg/mLaftertheidentificationofindirectimmunofluorescenceandWesternblot.Usingtherecombinantandpurif

7、iedE2proteinasantigen,anindirectELISAwassuccessfullydevelopedtodetectantibodytoBVDV.Theoptimalworkingparametersweredeterminedasfollows:therecombinantE2proteinantigenforcoatingat6μg/mL,testingseradilutionat1