小反芻獸疫病毒h蛋白的表達(dá)及其b細(xì)胞線性表位篩選

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1、分類號(hào)：０９３５單位代碼：１的６４密級(jí)：學(xué)號(hào)：１２７２０４０６么後朵！太葦學(xué)位論文小反當(dāng)獸疫病毒Ｈ蛋白的表達(dá)及其Ｂ細(xì)胞線性表位篩選Ｅｘｒｅｓｓ－ｐｉｏｎａｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇＢｃｅｌｌＬｉｎｅａｒＥｉｔｏｅｓｏｆｐｐＰＰＲＶＨｅｍａｌｕｔｉｎｉｎＰｒｏｔｅｉｎｇｇ研究生：高位相指導(dǎo)教師：張日月教ｊｆ合作指導(dǎo)教師：李震研究員申請(qǐng)學(xué)位口類級(jí)別：理學(xué)碩±專業(yè)名稱：微生物學(xué)研究方向：微生物生理學(xué)所在學(xué)院

2、：生命科學(xué)學(xué)院答辯委員會(huì)主席：對(duì)二零一五年五月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加抖標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)一的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。＞研究牛寐名；切或時(shí)間；年月＾日Ｊ關(guān)于論文使用授巧的說明目本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)

3、保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，Ｐ；學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，，允許論文被查閱和借閱可采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意農(nóng)業(yè)大學(xué)可Ｗ用不同方式在不同安徽上、。媒體發(fā)表傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵此協(xié)議（守）＞生簽杉；０／曰研名；為時(shí)間若年月究詞乂＞主一第導(dǎo)師簽名＝：年曰時(shí)間月＾摘要小反芻獸疫(PPR)是由小反芻獸疫病毒(PPRV)感染山羊、綿羊等家養(yǎng)和野生小反芻動(dòng)物的一種烈性、接觸性、傳染性疫病。2007年，在我國西藏

4、地區(qū)首次暴發(fā)小反芻獸疫。目前，我國已有20個(gè)省市相繼發(fā)現(xiàn)了感染病例。探索有效的快速診斷和防治相結(jié)合的防治措施對(duì)于及時(shí)應(yīng)對(duì)隨時(shí)可能發(fā)生的小反芻獸疫疫情具有重要的意義。本研究利用蛋白質(zhì)免疫印跡方法，以免疫的新西蘭大白兔血清為一抗，通過覆蓋H基因的重疊16肽片段與血清的特異性反應(yīng)，鑒定小反芻獸疫病毒H蛋白的線性B細(xì)胞表位。本文主要進(jìn)行了以下研究：1.PPRVH基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建以密碼子優(yōu)化的PestedespetitsruminantsvirusstrainChina/Tibet/Geg/07-30（FJ

5、905304）的H基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增H基因片段，構(gòu)建了1個(gè)克隆載體pJET1.2/blunt-PPRV-H和3個(gè)表達(dá)載體pET28a-PPRV-H，pET30a-PPRV-H和pET32a-PPRV-H。2.His-H蛋白的表達(dá)與純化對(duì)重組表達(dá)載體pET30a-PPRV-H的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定濃度為1mmol/LIPTG，誘導(dǎo)5h為最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。在此條件下，H蛋白主要以包涵體形式存在。通過尿素溶液洗滌包涵體，去除雜蛋白，純化和濃縮目的蛋白，濃縮后的蛋白濃度最高為2mg/mL。3.免疫血清的制備

6、以純化后的重組H蛋白免疫新西蘭大白兔（0.5mg/只），分別在14d、28d、42d加強(qiáng)免疫一次，56d頸動(dòng)脈采血收集血清。通過間接ELISA方法測(cè)定血清的滴度，1號(hào)，2號(hào)和3號(hào)兔子免疫血清的滴度分別達(dá)到1∶25600,1∶12800,1∶6400。從而說明獲得的抗血清可以特異性識(shí)別重組表達(dá)的His-H蛋白。4.H蛋白B細(xì)胞線性表位的篩選設(shè)計(jì)并合成覆蓋H基因16肽的基因序列，構(gòu)建表達(dá)載體pXXGST-3-P76-（1F~75F），將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。以兔抗H蛋白抗血清作為一抗，利用蛋白質(zhì)免疫

7、印跡來篩選重組表達(dá)的16肽片段，從而確定H蛋白的線性B細(xì)胞表位，結(jié)果共篩選出30個(gè)陽性的16肽。關(guān)鍵字：小反芻獸疫，小反芻獸疫病毒，H基因，H蛋白，線性B細(xì)胞表位篩選IAbstractPestedespetitsruminants(PPR)isanacute,contagiousdiseasecausedbypestedespetitsruminantsvirus(PPRV),whichinfectsmainlyhomebredandwildruminants,suchasgoatsandsheep.P

8、PRhasbeenreportedin20provincesinChinasinceitappearancedinTibetin2007.DevelopingprophylacticmeasuresconbinedrapiddiagnosiswithpreventionwillhaveagreatsignificanceforcopingwiththeunexpectedemergenceofPPRintime.Inthisstudy,We