水稻脆鞘基因bsh1的圖位克隆與功能分析

水稻脆鞘基因bsh1的圖位克隆與功能分析

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1、.?2..■-;<、—V'-入、.-.’.’.■...-一v.一''g:.軒J:.二二;:?'??1?中1.1.―''-"-I—吟/'-.:^一-*V^■—.—'V、?二VI密級:V:論文編號其:'■'-、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院"'^I;.V’,:學(xué)位論文'.,'-;興式,%;■■-1水稻脆銷基因公的圖位克隆與功能分析PositionalCloningandFunctionalStudyofBrittleS

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4、之后開始形成的,主要存在于厚壁組織和木質(zhì)部。深入研究細(xì)胞壁合成和裝配相關(guān)的基因可以幫助我們了解植物機械強度形成的分子機制。本研究鑒定了一個水稻矮化脆鞘的突變體bsh1,通過圖位克隆定位了BSH1,并利用分子生物學(xué)實驗初步研究了BSH1的生物學(xué)功能。主要結(jié)果如下:1.水稻脆鞘突變體bsh1的表型分析突變體bsh1在成熟期的株高、千粒重和單株產(chǎn)量都顯著下降。bsh1最顯著的變異是6周幼苗葉鞘的機械強度比野生型低,葉鞘變脆。透射電鏡觀察葉鞘厚壁細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)bsh1的細(xì)胞壁厚度降低。進一步分析野生型和突變體的細(xì)胞壁成分,結(jié)果顯示主要的細(xì)胞壁成分含量都不同程度地下降。2.BSH1編碼細(xì)胞色

5、素P450CYP96B4利用圖位克隆的方法,將突變基因精細(xì)定位在28kb區(qū)間內(nèi),通過測序發(fā)現(xiàn)在第二個ORF,即CYP96B4的啟動子區(qū)有一個未知長度的片段插入,并且突變體CYP96B4的表達量下降,因此我們將CYP96B4作為BSH1的候選基因?;パa試驗表明CYP96B4表達量升高的轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型類似,干擾植株中CYP96B4表達量下降的植株表型與突變體類似。因此,我們可以確定CYP96B4就是造成突變體bsh1矮化和脆鞘的BSH1基因。3.BSH1的亞細(xì)胞定位和時空表達模式觀察BSH1與GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)BSH1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Marker共定位,說明BSH1蛋

6、白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。定量PCR結(jié)果顯示BSH1在葉鞘中表達量最高,在根中最低。GUS染色分析表明BSH1在胚芽鞘、葉鞘、莖稈、葉片、根和穗子中都有表達。胚芽鞘和葉片的橫切可以看到GUS著色在維管束中,而葉鞘著色則在維管束周圍的細(xì)胞,根中的染色帶與厚壁細(xì)胞重疊。在第一節(jié)間較為幼嫩的部位有較深的染色。成熟組織中也檢測到了GUS活性,例如穗軸和小花,而且小花的染色會隨著小花的成熟擴展到整個穎殼。4.BSH1的功能分析在進化上,CYP96家族的成員被分為兩個分支,一支是包含OsCYP96B4的單子葉分支,另一支是包含AtCYP96A15的雙子葉分支。已經(jīng)報道的CYP96家族的成員的功能多樣

7、,既有負(fù)責(zé)脂肪酸修飾的基因,也有與抗病、抗逆相關(guān)的基因,但是大部分CYP96家族成員的功能未知。脂肪酸成分的檢測結(jié)果表明bsh1蠟質(zhì)總量從野生型950.70μg/g下降到突變體393.16μg/g,詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)每一種蠟質(zhì)成分含量都顯著下降,包括C30-C34的醛類,C29-C41的烷烴,C22-C32的脂肪酸和C26-C30的伯醇。而bsh1中角質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)脂肪酸和種子內(nèi)脂肪酸的變化不顯著。這些結(jié)果說明BSH1的功能與超長鏈脂肪酸及其衍生物的合成有關(guān)。對細(xì)胞壁合成基因表達量的分析結(jié)果顯示,所有

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