環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)阿薩希毛孢子菌的研究和應(yīng)用

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1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文目錄中文摘要……………………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………………………4英漢縮略對(duì)照表…………………………………………………………....7前言………………………………………………………………………....8材料和方法………………………………………………………………..18實(shí)驗(yàn)結(jié)果…………………………………………………………………..35討論………………………………………………………………………..51綜述………………………………………………………………………..60已發(fā)表的英文文章…

2、……………………………………………………..68-2-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在阿薩希毛孢子菌檢測(cè)中的應(yīng)用摘要研究背景阿薩希毛孢子菌(Trichosporonasahii，T.asahii)廣泛存在于自然界中，是一種條件致病真菌，在免疫缺陷、免疫抑制或免疫功能低下宿主能引起導(dǎo)致皮膚或臟器播散性感染，特別是器官移植、艾滋病或腫瘤患者中更易發(fā)生。近年來(lái)，在免疫功能正常人群阿薩希毛孢子導(dǎo)致的播散性感染的病例也逐漸增多。由阿薩希毛孢子菌引起的播散性毛孢子菌病早期診斷困難，進(jìn)展非常兇險(xiǎn)，疾病的致死率高，通常會(huì)累積多個(gè)重要臟器，并伴發(fā)急性進(jìn)行性呼吸衰竭，腎衰竭，播散性血管內(nèi)凝血等癥

3、狀，預(yù)后較差。阿薩希毛孢子菌傳統(tǒng)的診斷方法，如組織病理、真菌鏡檢和培養(yǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)、敏感度低，難以滿(mǎn)足臨床的需求，越來(lái)越多的研究致力于開(kāi)發(fā)取材方便、耗時(shí)短、準(zhǔn)確客觀、免培養(yǎng)的診斷方法，包括抗原檢測(cè)、影像學(xué)檢查、原位雜交和PCR診斷，雖然抗原檢測(cè)、影像學(xué)檢查已被批準(zhǔn)用于侵襲性真菌病的診斷，但在播散性毛孢子菌病的診斷中少有規(guī)范和應(yīng)用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者普遍采用分子生物學(xué)技術(shù)用于檢測(cè)毛孢子菌感染，其靈敏度高，周轉(zhuǎn)周期短并可鑒定致病性真菌到種等，有人認(rèn)為分子生物學(xué)技術(shù)是診斷真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)。目前國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分子診斷方法主要是傳統(tǒng)的PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)及巢式PCR技

4、術(shù)等。伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，新的核酸擴(kuò)增技術(shù)不斷出現(xiàn)。Notomi等于2000年報(bào)道了一種新的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(1oop-mediatedisothermal[12]amplification，LAMP)。該技術(shù)能在恒溫的條件下，快速、高效、特異的擴(kuò)增DNA。該技術(shù)的原理是針對(duì)靶基因的6個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)4種引物，利用一種鏈置活性的DNA聚合酶(BstDNApoly-merase)在恒溫條件(65℃左右)下催化新鏈的合成，從而實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增。由于在反應(yīng)的過(guò)程中出現(xiàn)大量的反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸根離子，并與鎂離子結(jié)合生成焦磷酸鎂沉淀。對(duì)沉淀進(jìn)行肉眼觀察，或者

5、通過(guò)濁度儀檢測(cè)焦磷酸鎂白色沉淀的混濁度來(lái)判定，也可在反應(yīng)管中加入熒光染色試劑，在肉眼或者紫外燈下觀察，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。該方法具有高特異性，高效性，快速，簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，目前已被廣泛報(bào)道應(yīng)用于細(xì)菌，病毒和寄生蟲(chóng)的檢測(cè)，并取得了理想的效果。隨著該方法的普及，近幾年，該方法在真菌診斷中的應(yīng)用亦有報(bào)道，但目前尚未有見(jiàn)該法用于毛孢子菌臨床檢測(cè)的報(bào)道。本研究應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，建立了一種新的阿薩希毛孢子菌快速檢測(cè)方法，具有較高的特異性和敏感性，并能應(yīng)用于臨床標(biāo)本，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和科研意義。-1-第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文研究目的：應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(1oop-m

6、ediatedisothermalamplification，LAMP)技術(shù)特異性檢測(cè)阿薩希毛孢子菌。比較環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)與傳統(tǒng)PCR法檢測(cè)阿薩希毛孢子菌的差異。材料與方法針對(duì)阿薩希毛孢子菌的IGS1序列而設(shè)計(jì)的特異性引物，選取15株阿薩希毛孢子作為待測(cè)菌株，14株阿薩希毛孢子菌菌株，23株其他臨床致病真菌作為陰性對(duì)照，對(duì)待測(cè)真菌中提取DNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)反應(yīng)，之后基于通過(guò)肉眼，濁度儀和產(chǎn)物凝

7、膠電泳等三種不同的方式觀察擴(kuò)增結(jié)果，驗(yàn)證引物的特異性。通過(guò)模板DNA稀釋不同濃度進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)反應(yīng)和傳統(tǒng)PCR實(shí)驗(yàn)，比較兩種檢測(cè)方法特異性差別。結(jié)果：1．應(yīng)用TA-19引物，14株阿薩希毛孢子菌菌株DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(1oop-mediatedisothermalamplification，LAMP)反應(yīng)后，可見(jiàn)特異性擴(kuò)增條帶和陽(yáng)性產(chǎn)物顯色反應(yīng)，濁度儀檢測(cè)可見(jiàn)特征性陽(yáng)性曲線(xiàn)。其他毛孢子菌菌株和常見(jiàn)臨床致病真菌未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。2．環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和傳統(tǒng)的PCR技術(shù)檢測(cè)阿薩希

8、毛孢子菌的