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1、碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌耐藥機制研究STUDYONCARBAPENEMRESISTANCEMECHANISMSOFACINETOBACTERBAUMANNII研究生姓名：應春妹學號：T2011007學科專業(yè)：內(nèi)科學指導教師：楊程德教授研究方向：細菌耐藥機制研究申請學位：博士培養(yǎng)單位：上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院國家自然科學基金面上項目（81371874）；資助項目：上海市科委課題（11ZR1421200）論文提交日期：2015年4月答辯日期：2015年4月III上海交通大學醫(yī)學院2011級博士研究生學位論文碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌耐藥機制研究摘要目的本研究通過了解我院鮑曼不動桿菌
2、感染情況、耐藥特征與流行趨勢，研究重癥監(jiān)護病房臨床菌株與環(huán)境菌株耐藥特征，檢測耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌水解酶及外排泵基因，檢測主動外排系統(tǒng)結構基因與調(diào)控基因在亞胺培南耐藥組(imipenem-resistantAcinetobacterbaumanniiIRAB)與敏感組(imipenem-sensitiveAcinetobacterbaumanniiISAB)中分布差異，對主要外排基因進行表達量分析，并研究外膜蛋白Omp34介導鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥，深入探討鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制。方法1、本實驗收集2012年7月到10月我院臨床分離鮑曼不動桿菌共78株，并采用
3、ERIC-PCR及PFGE技術對該78株臨床分離株進行同源性分析，了解本院鮑曼不動桿菌是否存在克隆株的播散流行。2、同期采用瓊脂稀釋法檢測神經(jīng)外科重癥監(jiān)護病房（IntensiveCareUnit，ICU）27株臨床菌株和28株環(huán)境菌株對常用抗菌藥物的最低抑菌濃度；用腸桿菌科基因間重復序列PCR（EnterbacteriatRepetitiveIntergenicConsensus,ERIC-PCR）、多位點序列分型（MultiLocusSequenceTyping,MLST）及脈沖場凝膠電泳（PulsedFieldGelelectrophoresis，PFGE）技術對共分離的55株鮑曼
4、不動桿菌進行基因分型，分析其可能的傳播途徑。3、采用聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction，PCR）檢測78株臨床菌株β-內(nèi)酰胺酶基因（OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP-1、VIM-1、VIM-2、Amp-C）及RND家族3個主要外排系統(tǒng)AdeABC、AdeIJK及AdeFGH結構基因（adeB、adeJ、adeF、adeG、adeH）與調(diào)控基因（adeR、III上海交通大學醫(yī)學院2011級博士研究生學位論文adeS、adeL）的攜帶情況，比較其在IRAB及ISAB中分布差異，進一步使用Realtime-PCR對其主要外排基因進行表達
5、量分析，初步探討鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥機制。4、研究通過采用雙重同源重組技術在鮑曼不動桿菌ATCC19606中構建Omp34基因的缺失突變株（ATCC19606-△Omp34），采用十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PolyacrylamideGelElectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白電泳分析外膜蛋白的表達，PCR法和基因測序進一步驗證Omp34基因敲除。比較野生株和敲除株對常用抗菌藥物尤其是碳青霉烯類的抑菌圈大小，以探討外膜蛋白Omp34在介導鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥中的作用。結果1、臨床分離78株鮑曼不動桿菌只對米諾環(huán)素耐藥率稍低，為30.9
6、%；其次為亞胺培南，耐藥率為53.1%；對其它抗菌藥物耐藥率均超過60%；對頭孢西丁、復方新諾明耐藥率最高，分別為97.5%、93.8%。78株鮑曼不動桿菌ERIC-PCR結果顯示可分為A、B、C、D、E、F6型，A型62株，為主要克隆株，其中A型又分為A1型46株，A2型16株，B型7株，C型6株，D、E、F型各1株。PFGE主要分為7型，A型56株（包括A1、A2、A3三個亞型），B型7株，C型4株，D型5株，E型3株，F(xiàn)型2株、G型1株。2、臨床分離27株鮑曼不動桿菌除對替加環(huán)素、粘菌素全部敏感，對其他14種抗菌藥物普遍耐藥，米諾環(huán)素耐藥率稍低，為25.9%。其次為頭孢哌酮/舒巴
7、坦與亞胺培南，耐藥率分別為51.9%、59.3%，對其他抗菌藥物的耐藥率均超過70%，對復方新諾明全部耐藥。環(huán)境分離28株鮑曼不動桿菌相比臨床分離菌株更為敏感，替加環(huán)素和粘菌素全部敏感，對美羅培南和頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率均為3.6%，對與亞胺培南耐藥率為7.1%，對米諾環(huán)素、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率均為10.7%，對頭孢西丁耐藥率最高，為92.9%。27株臨床分離鮑曼不動桿菌ERIC-PCR基因分型主要為A、B、C三型，其中A型20株，B型6
