尼羅羅非魚(yú)t細(xì)胞激活相關(guān)基因的功能研究

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1、分類號(hào):Q786密級(jí)：公開(kāi)UDC：577學(xué)號(hào)：2111201U3r海洋太f碩士學(xué)位論文尼羅羅非魚(yú)T細(xì)胞激活相關(guān)基因的功能研究甘楨指導(dǎo)教師：魯義善教授串請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)名稱：水產(chǎn)養(yǎng)殖研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物免疫學(xué)及病害控制學(xué)院名稱：水產(chǎn)學(xué)院—中國(guó)?湛江2015年6月、、、.’(、機(jī)齡:入嗲像鉿夂答辨奏炎會(huì)極祆主席：^?導(dǎo)師：暴碌時(shí)間：24尋$料0學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其它個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰與的成果作

2、品。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名：20/f年g月;日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)廣東海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于1、保密□，在______年解密后適用本授權(quán)書(shū)。2、不保密B。(請(qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)方框內(nèi)打“V”

3、）作者簽名:導(dǎo)師簽名:尼羅羅非魚(yú)T細(xì)胞激活相關(guān)基因的功能研究摘要羅非魚(yú)是一種在全世界廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，近年來(lái)，以鏈球菌病為代表的羅非魚(yú)病害頻繁發(fā)生，給羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。由于其較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)羅非魚(yú)病害的研究逐漸成為水產(chǎn)動(dòng)物病害防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而由無(wú)乳鏈球菌引起的鏈球菌病是其中一個(gè)主要的研究方向。然而，目前關(guān)于羅非魚(yú)的T細(xì)胞，特別是關(guān)于T細(xì)胞激活方面的研究還十分有限。CD59、CD2BP2和Lck是三種與共刺激分子CD2存在互作的關(guān)鍵蛋白分子，在CD2介導(dǎo)的T細(xì)胞激活中起到著至關(guān)重

4、要的作用。為了解羅非魚(yú)T細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)寄生菌的免疫應(yīng)答機(jī)制，本研究以尼羅羅非魚(yú)（Oreochromisniloticus）為研究對(duì)象，克隆了尼羅羅非魚(yú)CD59、CD2BP2和Lck的cDNA序列全長(zhǎng)，并對(duì)其組織分布、對(duì)無(wú)乳鏈球菌刺激的免疫應(yīng)答以及功能特征進(jìn)行了初步的研究。CD59是一種重要的補(bǔ)體抑制蛋白和T細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白，在非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答中都發(fā)揮著重要的作用。在本研究中，尼羅羅非魚(yú)的CD59基因（簡(jiǎn)稱為On-CD59）被成功克隆，序列分析結(jié)果表明On-CD59的cDNA全長(zhǎng)為1176bp，包含一段長(zhǎng)為74bp的5'端

5、非編碼區(qū)、一段長(zhǎng)為748bp的3'端非編碼區(qū)以及一段長(zhǎng)為354bp、編碼117個(gè)氨基酸的開(kāi)放式閱讀框（ORF）。On-CD59所推測(cè)的氨基酸序列具有已知CD59分子所具有的五大特征結(jié)構(gòu)，包括N端的信號(hào)肽、C端的GPI錨定區(qū)、中間的LU結(jié)構(gòu)域、CCXXXXCN基序以及10個(gè)半胱氨酸殘基。在健康的羅非魚(yú)中，On-CD59mRNA的表達(dá)在本研究所檢測(cè)的所有組織中都能被檢測(cè)到，其中在腦的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織；在經(jīng)滅活無(wú)乳鏈球菌刺激24h后，On-CD59mRNA在皮膚、大腦、頭腎、胸腺和脾臟的表達(dá)都發(fā)生了顯著的上調(diào)。此外，在滅活無(wú)乳鏈球

6、菌刺激后，On-CD59的表達(dá)在皮膚、腦、頭腎、胸腺和脾臟表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性表達(dá)模式，On-CD59在皮膚的表達(dá)水平于免疫12h后達(dá)到峰值，而在腦和頭腎則是于免疫24h后達(dá)到峰值，在胸腺和脾臟到達(dá)峰值的時(shí)間最晚，為免疫48h后。補(bǔ)體抑制活性試驗(yàn)結(jié)果表明On-CD59不但具有補(bǔ)體抑制活性，而且這種活性具有物種選擇性。而生物素-鏈霉親和素ELISA以及集落形成單位試驗(yàn)結(jié)果則分別表明，On-CD59能結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的主要組分PGN和LTA，并對(duì)無(wú)乳鏈球菌具有一定的抗菌活性。CD2BP2是幾種與CD2胞質(zhì)區(qū)結(jié)合的接頭蛋白之一

7、，在CD2介導(dǎo)的T細(xì)胞激活以及核剪接中都起著關(guān)鍵的作用。在本研究中，尼羅羅非魚(yú)的CD2BP2基因（簡(jiǎn)稱為On-CD2BP2）被成功克隆，序列分析結(jié)果表明On-CD2BP2的cDNA全長(zhǎng)為1429bp，包含一段長(zhǎng)為111bp的5'端非編碼區(qū)、一段長(zhǎng)為193bp的3'端非編碼區(qū)以及一段長(zhǎng)I為1125bp、編碼374個(gè)氨基酸的開(kāi)放式閱讀框。On-CD2BP2所推測(cè)的氨基酸序列具有已知CD2BP2分子所具有的兩大特征結(jié)構(gòu)，即C端的GYF結(jié)構(gòu)域和GPFXXXXMXXWXXXGYF基序，且其所推測(cè)的基因結(jié)構(gòu)與已知的CD2BP2分子十分相似。

8、在健康的羅非魚(yú)中，On-CD2BP2mRNA在頭腎、脾臟和肝臟的表達(dá)量較高；在經(jīng)滅活無(wú)乳鏈球菌刺激48h后，On-CD2BP2mRNA在頭腎、脾臟和腦的表達(dá)都發(fā)生了顯著的上調(diào)。此外，在滅活無(wú)乳鏈球菌刺激后，On-CD2BP2在頭腎、脾臟和腦的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的時(shí)間