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《斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白y和e基因的克隆及相關(guān)表達(dá)分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、學(xué)校代碼：10264研究生學(xué)號(hào)：M120150351上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Y和E基因題目：的克隆及相關(guān)表達(dá)分析MolecularcloningandrelatedexpressionanalysisofcyclinYandcyclinEgenesfromblack英文題目：tigershrimp(Penaeusmonodon)專業(yè)：漁業(yè)研究方向：斑節(jié)對蝦海洋分子生物學(xué)姓名：李偉杰指導(dǎo)教師：邱麗華研究員二O一五年六月上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)
2、風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我對所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé)，完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有
3、關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密□，在年解密后適用本版權(quán)書。本學(xué)位論文屬于不保密□學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文上海海洋大學(xué)博/碩士學(xué)位論文答辯委員會(huì)成員名單姓名工作單位職稱備注答辯地點(diǎn)答辯日期上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白Y和E基因的克隆及相關(guān)表達(dá)分析摘要斑節(jié)對蝦屬于甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、游泳亞目（Natantia）、對蝦科（penaeidae）、對蝦屬（pe
4、naeus），是對蝦屬中較大一種，具有很高的經(jīng)[1]濟(jì)和營養(yǎng)價(jià)值。但是，在斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖過程中，親蝦繁育技術(shù)一直是一個(gè)非常重[2,3]要的限制因素。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們越來越關(guān)注甲殼類動(dòng)物尤其是對蝦中細(xì)胞周期蛋白基因的功能，對細(xì)胞周期蛋白的分子調(diào)控機(jī)制已有所研究。細(xì)胞周期蛋白是參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要因子，細(xì)胞周期中，細(xì)胞周期蛋白[4]家族的變化決定著細(xì)胞周期中的一系列過程，如DNA復(fù)制、染色體加倍、時(shí)相轉(zhuǎn)換、細(xì)胞周期的起始與結(jié)束等等。有研究報(bào)道，在斑節(jié)對蝦性腺發(fā)育的相關(guān)功[5]能基因中，細(xì)胞周期素
5、對其正常的生長、繁殖、發(fā)育和遺傳具有決定性作用。[6,7]因此，在對斑節(jié)對蝦親蝦繁育的探尋和研究中，與斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白家族基因成為研究熱點(diǎn)。在本研究中，從分子水平和蛋白水平層面，我們對斑節(jié)對蝦的細(xì)胞周期蛋白Y（Pm-cyclinY）基因進(jìn)行了研究，探索Pm-cyclinY與斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的相關(guān)性，以期為斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理充實(shí)理論依據(jù)。另外，在本實(shí)驗(yàn)室對斑節(jié)對蝦細(xì)胞周期蛋白E（Pm-cyclinE）已有研究的基礎(chǔ)上，我們對Pm-cyclinE做了進(jìn)一步探索，以期為Pm-cyc
6、linE的蛋白相互作用研究奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)首先通過對斑節(jié)對蝦進(jìn)行高通量測序，建立EST文庫，篩選出與斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白Y的EST序列。其次，在基因水平上：設(shè)計(jì)引物，利用SMART-RACE技術(shù)克隆出全長基因的cDNA序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；設(shè)計(jì)特異性引物，利用基因組步移技術(shù)得到目的基因的基因組全序列，找到啟動(dòng)子，并對其結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對目的基因在斑節(jié)對蝦卵巢、肝胰腺、眼柄等10個(gè)組織中的分布及卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行研究，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)
7、果，從而在mRNA水平探索目的基因與斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的關(guān)系。然后，在蛋白水平上，構(gòu)建Pm-cyclinY與載體pET21a的重組質(zhì)粒，在經(jīng)優(yōu)化后的原核表達(dá)條件下，誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白；用鎳柱親I上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文和層析方法純化蛋白，檢測達(dá)到規(guī)定濃度后送公司做抗體；得到的斑節(jié)對蝦目的基因多克隆抗體用于斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育各期的免疫印跡和免疫組化實(shí)驗(yàn)，從而達(dá)到在蛋白水平探索目的基因與斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的關(guān)系。除此之外，對于Pm-cyclinE，結(jié)合已有研究報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)室已有研究基礎(chǔ)，我們對其補(bǔ)充了在斑節(jié)對蝦卵
8、巢發(fā)育各期的mRNA水平驗(yàn)證，并且在蛋白水平做了原核表達(dá)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，并利用pull-down技術(shù)對Pm-cyclinE在蛋白相互作用方面做了初步探索。結(jié)果概述如下：1）Pm-cyclinY基因cDNA全長1576bp，其中包含108bp的5‘非編碼區(qū)(UTR)和439bp的3‘非編碼區(qū)（UTR）以及1029bp的開放閱讀框(ORF)，可編碼342個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，其編碼的氨基酸序列有一個(gè)保守的周期蛋白框(c
