atsus3基因的克隆及對棉花的遺傳轉(zhuǎn)化研究

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1、分類號Ｑ９４３密級公開學(xué)號１３２１４３碩±學(xué)位論文（學(xué)術(shù)型）題目巧基因的克隆及對棉花的遺傳轉(zhuǎn)化研究作者蔡云巧指導(dǎo)教師喻嘉寧教授—級學(xué)科名稱生物學(xué)二級學(xué)科名稱生物化學(xué)與分子生物學(xué)提交日期二〇—六年五月學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我在導(dǎo)師的指導(dǎo)下進(jìn)行研巧工作所取得的研究成果？盡我所知，除文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容和致謝的地方外，本論文不包含其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或揉寫過的研巧成果，也不包含本人或他人己申請學(xué)位或其他用途使用過的成果。對本文的研巧做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均

2、已在文中作了明確說明并表示謝意。一本學(xué)位論文若有不實或者侵犯他人權(quán)利的。，本人原意承擔(dān)切相關(guān)的法律責(zé)任璋、心作者簽名：ｂ曰期：如月曰／以學(xué)位論文知識產(chǎn)權(quán)及使用授權(quán)聲明書本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的學(xué)位論文及相關(guān)成果，知識產(chǎn)權(quán)巧屬陜西師范大學(xué)。本人完全了解陜西師范大學(xué)有關(guān)保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，允許本論文被査閱和借閱，學(xué)校存反保留學(xué)位論文并向國家有關(guān)部口或妍構(gòu)送交論文的紙質(zhì)版和電子版，有權(quán)將本論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可抖采用任何復(fù)制手段保存？本人保證畢業(yè)離校后和匯編本論文，發(fā)表本論文或使用本論文成果時署名單

3、位仍為陜西師范大學(xué)。保密論文解密后適用本聲明。作者簽名：丟今鳴曰期：年Ｊ月曰摘要一。棉花，錦葵科棉屬植物，是世界上主要的經(jīng)濟(jì)作物之棉纖維由胚珠部分＇表皮細(xì)胞發(fā)育形成ｅ－ｃｏｓｅ，涉及許多基因的表達(dá)調(diào)控。ＵＤＰＧ（ｕｒｉｄｉｎ５ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕ）是纖維素合成的底物，庶糖合成酶（ＳｕｃｒｏｓｅＳｙｎｔｈａｓｅ，ＳｕＳｙ表皮細(xì)胞產(chǎn)生）可作用于ＵＤＰＧ，同時降低細(xì)胞中ＵＤＰ（ｕｒｉｄｉｎｅ郵ｈｏｓｐｈａｔｅ）的含量，提髙細(xì)胞膨壓，促進(jìn)細(xì)胞伸長及纖維素合成。棉花無絨毛突變體和野生型０ＤＰＡ（ｄａｙｐｏｓｔａｎｔｈｅ

4、ｓｉｓ）的胚珠比較，表皮細(xì)胞突起銳減，同時未檢測到ＳｕＳｙ的轉(zhuǎn)錄及酶活性。棉花中庶糖合成酶３（沉胤）基因的低表達(dá)，會導(dǎo)致０ＤＰＡ胚珠表面突起減少，３ＤＰＡ的棉纖維變短。知Ｓｔ／Ｗ基因的表達(dá)Ｓｔ／Ｓ成員本實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)干涉擬南芥，引起其它代償性増加，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥抽苔、果實成熟，其角果產(chǎn)率也均高于野生型植株。在此基礎(chǔ)上，，本研究克隆了如沉化？基因并將此基因連接植物表達(dá)載體ＰＢＩ１２１，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿茜ＬＢＡ４４０４，利用兩種方法對棉花進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，Ｗ期獲得轉(zhuǎn)Ａ沉度３棉。己取得的結(jié)果如下：１．克隆心化／說基因。從擬南芥

5、中克隆處沉７５義該基因ｃＤＮＡ全長２４３０ｂｐ，編．００ｋＤａ．碼８０９個氨基酸，Ａ怯ＵＳ３的分子量為９２，理論等電點(diǎn)為５８５，疏水性平－０均值為．２７６ｅｕ，，含量最豐富的氨基酸為ＬＧ山，Ｖａｌ，創(chuàng)ｙ。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明Ａ怯ＵＳ３蛋白屬于糖基轉(zhuǎn)移酶家族，含有２個功能域，即Ｎ端的薦糖合成結(jié)構(gòu)－３４螺旋占．４９％域和Ｃ端的糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域。在Ａ議ＵＷ的二級結(jié)構(gòu)中，ａ，隨機(jī)。－卷曲占４８．９５％，延伸鏈占１６．５６％其中，ａ螺旋和隨機(jī)卷曲是ＡｔＳＵＳ３最主要的結(jié)構(gòu)元件。－人ＳＷ３２．構(gòu)建表達(dá)載體。將如化獻(xiàn)基因連入表達(dá)載體ＰＢＩ１２

6、１，命名為：ｐＢＩｌ＾，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌ＬＢＡ４４０４中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花下胚軸轉(zhuǎn)化法對棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)化。選取飽滿、脫絨的棉種無菌培養(yǎng)，將生長７天后的棉花子葉下胚軸切段，通過農(nóng)桿菌侵染３分鐘，漂洗后共培養(yǎng)４８小時，在抗性培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，再一進(jìn)步誘導(dǎo)形成胚巧愈傷組織。，通過化胎發(fā)生等過程獲得再生植株３．分析嫁接方法。分別對劈接法，合接法，貼接法等方法進(jìn)行分析，結(jié)果表明；嫁接±培苗時合接法成活率最高，劈接法嫁接后棉苗生長最好。無菌苗嫁接中，。劈接法成活率最高，棉苗生長良好４．獲得轉(zhuǎn)瓜Ｓｔ／Ｗ棉花。轉(zhuǎn)佔(zhàn)ｔ／Ｗ基因的再生植株通過劈接

7、法嫁接獲得１９株轉(zhuǎn)火ＳＬ獻(xiàn)棉花。通過ＥＬＩＳＡ方法研究了轉(zhuǎn)基因棉花中庶糖合成酶（ＳｕＳ）薦糖轉(zhuǎn)ｙ，Ｉ化酶（ＩＮＶ），瞧糖碟酸合成酶（ＳＰＳ）的含量及酶活性，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因棉花普遍高于野生型棉花，但各陽性株系間存在差異。５．探索棉花活體胚轉(zhuǎn)化外源基因的方法。用含外源基因ＧＦｆ的農(nóng)桿菌侵染去掉？半個子葉的棉花種子胚，農(nóng)桿菌〇〇６〇〇為０．４０．６，侵染３小時，共培養(yǎng)４８小時，用含１００ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＭＳ基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選，生長３０天后的棉苗在卡那霉素敏感性實驗具有抗性，在ＤＮＡ水干，轉(zhuǎn)錄水平上均可檢測到ＧＦｆ，棉花葉片也可檢

8、，，測到綠色巧光，但４０天后外源基因表