基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用簡介

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1、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及其應(yīng)用簡介報(bào)告人:陳紅平2006年11月安德魯·法爾和克雷格·梅洛報(bào)告內(nèi)容一、基因轉(zhuǎn)染簡介二、基因轉(zhuǎn)染的基本方法三、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用1.基因轉(zhuǎn)染:將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能。2.基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究和基因治療研究。一、基因轉(zhuǎn)染簡介二、基因轉(zhuǎn)染的基本方法(一)重組子構(gòu)建(二)基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的基本方法(一)重組子構(gòu)建1.目的基因的制備和獲取2.哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇3.DNA片斷的重組連接4.DNA重組體的鑒定(1)目的基因是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因或基因的一個(gè)片段(2

2、)目的基因常用的制備方法1.目的基因的制備和獲取A.限制酶切除a.從原核基因組DNA制備－視原核基因組物理圖譜已知或未知，克隆方法不同。b.從真核基因組DNA制備c.從已克隆的DNA片段制備B.PCR或RT/PCR方法制備目的基因a.獲取已知基因據(jù)已發(fā)表的基因序列（或基因兩側(cè)序列已知）→設(shè)計(jì)/合成一對引物→PCR（基因組DNA為模板）/RT-PCR(mRNA為模板)→從組織或細(xì)胞制備目的基因b.構(gòu)建RT/PCR文庫法獲取未知基因據(jù)mRNA末端如polyA尾設(shè)計(jì)共同引物→將所用mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾→采用一對共用引物擴(kuò)增所有cDNA，插入

3、適當(dāng)載體→構(gòu)成PCR－cDNA文庫篩選C.計(jì)算機(jī)克?。蠢肎enBank信息，利用不同種屬同源性設(shè)計(jì)引物，嘗試獲取未知基因片段，這有賴于各種計(jì)算機(jī)軟件的應(yīng)用。D.化學(xué)合成法制備基因片段－用DNA合成儀，對目的基因分段合成，連接，可以得到所需的目的基因。2.哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的選擇哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體有2大類：質(zhì)粒型載體和病毒型載體（1）質(zhì)粒型載體哺乳動物細(xì)胞質(zhì)粒型載體大多數(shù)是通過細(xì)菌質(zhì)粒而獲得的，主要是在質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入了一些病毒或其他一些物種及人的基因表達(dá)調(diào)控序列。A.典型的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體需要以下順式作用元件:a.啟動子b.增強(qiáng)子c.多聚腺苷酸化信號d.藥

4、物選擇標(biāo)記基e.報(bào)告基因f.表位標(biāo)簽B.常用的哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒載體a.pcDNA3.lb.pSIc.pCMV-HAd.pBudCE4.1e.pTRE（2）病毒型載體病毒型載體已被廣泛地用于將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞或替換哺乳動物細(xì)胞中的缺陷基因，這類載體將來在基因治療中將具有非常重要的價(jià)值。目前應(yīng)用的病毒類型包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、牛痘病毒和桿狀病毒等。A．逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒的優(yōu)點(diǎn)是，可以使外源基因整合到基因組中，因而可以被穩(wěn)定傳代和表達(dá)。但是，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，因而在基因組內(nèi)的整合有可能破壞一些內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)，尤其是當(dāng)插人到一些重要的基因位點(diǎn)

5、時(shí)會導(dǎo)致細(xì)胞的異常。B.腺病毒載體易于培養(yǎng)、純化，在感染過程中復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴于宿主細(xì)胞的聚合酶，可插入較大的外源基因片段，且腺病毒基因不會發(fā)生整合，是研究真核基因的良好模型。3.DNA片斷的重組連接粘端連接方法要點(diǎn)平端連接方法要點(diǎn)①單酶單切點(diǎn)防自身環(huán)化，希望定向插入；②雙酶雙切點(diǎn)定向克隆，構(gòu)建表達(dá)載體的最好用此法；③利用同裂解酶產(chǎn)生相同粘端。①平端，平端連接；②Linker連接酶切產(chǎn)生粘端連接；③Adaptor銜接目的基因和載體；④同源同聚尾，克隆cDNA的最好方法⑤T載體，PCR產(chǎn)物T/A克隆法連接。4.DNA重組體的鑒定外源DNA片斷是否插入載體構(gòu)成重組DNA分子

6、，而插入片斷大小，是否突變及插入位置，順序及方向則關(guān)系到構(gòu)建載體是否擴(kuò)增，我們所需要的基因或表達(dá)，表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)品，所以需要進(jìn)一步鑒定DNA重組體（1）酶切鑒定是必需的，基于下述:A.限制性圖譜個(gè)體特異性，不同的載體或DNA分子物理圖譜不同，酶切后片段大小不一樣，電泳圖譜不一樣。B.同一載體連接不同的DNA片斷，不同的載體連接同一片段(片段上也有位點(diǎn)）酶切圖譜是不同的。C.插入法(單酶單切點(diǎn))或替代法(雙酶雙位點(diǎn))酶切，一般來說用3種限制酶切：①可鑒定載體及②插入片段的大小,方向,切后并電泳分析,以確定是否得到預(yù)期的rDNA。（2）若構(gòu)建DNA重組體是為了克隆某個(gè)基因，

7、可進(jìn)行在序列測定。（3）若構(gòu)建表達(dá)載體，可進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物鑒定。對外源基因轉(zhuǎn)染方法的要求包括：轉(zhuǎn)移效率高，不影響細(xì)胞的正常生理活動，低毒性，容易使用，重復(fù)性好，易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。根據(jù)轉(zhuǎn)染的機(jī)制不同可將轉(zhuǎn)染法分為：1.化學(xué)轉(zhuǎn)染法2.物理轉(zhuǎn)染法3.病毒感染法(二)基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的基本方法1.化學(xué)轉(zhuǎn)染法化學(xué)轉(zhuǎn)染法包括DEAE一葡聚糖法、磷酸鈣法和人工脂質(zhì)體法等。目前應(yīng)用最廣泛的是人工質(zhì)體法。1.DEAE-葡聚糖是最早應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染的試劑之一。DEAE-葡聚糖是陽離子多聚體,它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取。DEAE一葡聚糖轉(zhuǎn)染已成功地應(yīng)用于瞬時(shí)