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《賴(lài)氨酰氧化酶基因原核表達(dá)克隆的構(gòu)建》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、賴(lài)氨酰氧化酶基因原核表達(dá)克隆的構(gòu)建作者：擺茹，楊偉，趙建寧，韓梅【摘要】目的克隆編碼人賴(lài)氨酰氧化酶(hLOX)的基因片段，并構(gòu)建含有該基因的重組原核表達(dá)質(zhì)粒，為制備基因工程化的重組hLOX奠定基礎(chǔ)。方法從人皮膚成纖維細(xì)胞中抽提RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增LOX編碼序列(750bp)，所得目的基因插入原核表達(dá)載體質(zhì)粒pET28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。重組質(zhì)粒pET28a-hLOX經(jīng)雙酶切和核苷酸序列分析鑒定。結(jié)果載體質(zhì)粒pET28a中插入的基因片段與hLOX基因序列完全相同。結(jié)論成功構(gòu)建含有人LOX基因的重組表達(dá)質(zhì)粒?！娟P(guān)鍵詞】
2、賴(lài)氨酰氧化酶;RT-PCR;重組質(zhì)粒賴(lài)氨酰氧化酶(Lysyloxidase，LOX)是一種細(xì)胞外依賴(lài)銅的胺氧化酶，參與細(xì)胞外基質(zhì)中膠原和彈性蛋白賴(lài)氨酸殘基交聯(lián)，在膠原和彈性蛋白由可溶性單體轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維過(guò)程的初始階段發(fā)揮重要作用，對(duì)建立細(xì)胞外基質(zhì)和維持基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能正常，以及組織器官發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等都具有重要意義[1-2]。本研究選取32KD的賴(lài)氨酰氧化酶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，擬從人皮膚成纖維細(xì)胞中克隆出目的基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，為今后表達(dá)重組hLOX、深入研究該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能打下基礎(chǔ)。7 1材料與方法 1.1細(xì)胞
3、與試劑人皮膚成纖維細(xì)胞、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a，E.coilDH5ɑ，均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病研究所一室提供。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料所，胰蛋白酶購(gòu)自Difco公司。TRIZOL試劑購(gòu)自Gibco公司，TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)、EcoRI、HindIII內(nèi)切酶、切膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取、DNAmarker均購(gòu)自TaKaRa公司?！ ?.2細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清/青霉素(100U/mL)/慶大霉素(100U/mL)的DMEM培養(yǎng)液
4、中，置于飽和濕度，37℃、5%CO2的孵箱中生長(zhǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，進(jìn)行總RNA的提取?！ ?.3總RNA的提取和cDNA的合成按說(shuō)明書(shū)步驟用Trizol抽提細(xì)胞總RNA。測(cè)定RNA樣品在λ=260nm和λ=280nm的光密度值確定RNA的純度，按1OD260=40μgRNA計(jì)算RNA的濃度。按照cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明合成cDNA第一鏈?！ ?.4PCR擴(kuò)增目的基因hLOX根據(jù)GeneBank公布的hLOX序列(GeneBankNM_002317)和載體質(zhì)粒pET28a的多克隆位點(diǎn)和閱讀框圖譜設(shè)計(jì)引物，選擇EcoRⅠ和H
5、indⅢ作為將hLOX基因插入載體的內(nèi)切酶。引物序列為：上游：5'-CGGAATTCATGGACGACCCTTACAACCCCT-3'7含起始密碼和EcoRI酶切位點(diǎn);下游：5'-GCGCAAGCTTCTAATACGGTGAAATTGTGC-3'含終止密碼和HindIII酶切位點(diǎn)。以1ststrandcDNA為模板擴(kuò)增帶有酶切位點(diǎn)的目的基因，目的片段約750bp。同時(shí)用管家基因(GAPDH)作為對(duì)照檢測(cè)總RNA的完整性和逆轉(zhuǎn)錄的效率。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，紫外燈下迅速切割含750bp條帶的凝膠條塊，用小量膠回收試劑盒提
6、取純化PCR產(chǎn)物?！ ?.5重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及核苷酸序列分析回收產(chǎn)物hLOX與質(zhì)粒pET28a分別用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切4h，酶切產(chǎn)物分別割膠回收。將目的片段與載體質(zhì)粒用T4DNAligase連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化E.coilDH5α感受態(tài)細(xì)菌。挑克隆經(jīng)菌落PCR，雙酶切鑒定為陽(yáng)性克隆，保種待用。經(jīng)篩選的重組質(zhì)粒作核苷酸序列分析。并用DNAstar軟件將測(cè)序結(jié)果與GeneBank公布的hLOX序列(GeneBankNM_002317)對(duì)比，同時(shí)鑒定插入片段兩側(cè)的酶切位點(diǎn)、起始及終止密碼。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET28a-h
7、LOX?！ ?結(jié)果 2.1目的基因hLOX的RT-PCR電泳 RT-PCR擴(kuò)增后樣品組特異性擴(kuò)增產(chǎn)物大小750bp，管家基因?qū)φ战M約500bp，見(jiàn)圖1?！ ?.2重組原核表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定7 重組表達(dá)載體pET28a/hLOX經(jīng)內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindIII酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外燈下觀察，可見(jiàn)與理論值大小相符的兩個(gè)條帶，片段大小分別為750bp和5369bp(圖2)，分別為hLOX基因片段和pET28a載體片段?！ ?.3目的基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)雙酶切初步鑒定的重組質(zhì)粒送樣進(jìn)行DNA測(cè)序(北京三博遠(yuǎn)志生物有限公司)
8、。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，克隆序列與GeneBank所公布序列(GeneBankNM_002317)100%吻合。測(cè)序結(jié)果如圖3(見(jiàn)封2)?！ ?討論 LOX存在于人類(lèi)、小鼠、大鼠、雞、魚(yú)等多種生物體中，廣泛分布于多種組織器官，在心、肝、肺、子宮、卵巢、皮
