擬南芥三螺旋轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫反應(yīng)中的功能研究

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1、密級：中國科學(xué)院大學(xué)UniversityofChineseAcademyofSciences博士學(xué)位論文二。一三年三月申請博士學(xué)位』㈣舢U

2、l刪IIIII舢IIIII刪IIIII舢IIY2381190。擬南芥三螺旋轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫反應(yīng)中的功能研究研究生：王曉紅(2006級碩博)導(dǎo)師：張勁松(研究員)陳受宜(研究員)專業(yè)：遺傳學(xué)中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所二O一三年三月FunctionalanalysisofArabidopsistrihelixtranscriptionfactorsundersaltstressByXia

3、o—HongWangADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofNaturalScienceInstituteofGeneticsandDevelopmentalBiologyChineseAcademyofSciencesMarch，2013獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的博士學(xué)位論文“拯直薟三螺旋棱丞固王在墊然迫廈廛史的功篚嬰究”，是

4、本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)加以標注和致謝的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品／研究成果，也不包含為獲得任何教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。對本論文研究做出重要貢獻的其他個人和集體均已在論文中以明確方式標明并表示謝意。申請學(xué)位的論文與資料若有不實之處，本人愿承擔(dān)一切責(zé)任。學(xué)位論文作者(需親筆)簽名：習(xí)衡弘沙眺硼／；年9夕日摘要擬南芥三螺旋轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫反應(yīng)中的功能研究鹽脅迫嚴重影響了全球的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因此研究植物耐鹽機理，對于在分子水平上改良農(nóng)作物以提高其耐鹽性有著深

5、遠的意義。轉(zhuǎn)錄因子對于目標基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，三螺旋轉(zhuǎn)錄因子作為植物中特有的一類小的轉(zhuǎn)錄因子家族，在研究初期發(fā)現(xiàn)參與了對植物光應(yīng)答的調(diào)控，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)這類轉(zhuǎn)錄因子也參與對植物生長發(fā)育、生物脅迫及非生物脅迫的調(diào)控，但這個家族基因參與鹽脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機理還鮮有報道。本研究分析了擬南芥30個三螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)}、旱、冷脅迫以及ABA和ethylene處理的應(yīng)答模式，并從中選擇了GT-4、GT-3a和GT-3b進行了深入的研究，希望進一步深化對擬南芥中三螺旋轉(zhuǎn)錄因子參與鹽脅迫響應(yīng)機理的認識

6、。qRT-PCR研究表明，GT-4的表達受到鹽、旱脅迫和ABA、ACC等處理的誘導(dǎo)；GT-4在各種器官中廣泛表達，在蓮座葉片中的表達量最高，根中的表達量最低。與C01．0相比，gt一4突變體無論在1／2MS培養(yǎng)基上還是蛭石中對NaCl處理均是敏感的，而高表達GT-4的轉(zhuǎn)基因株系對NaCl的處理表現(xiàn)出耐性：相對離子滲透率分析表明，NaCl處理后，∥．4突變體的相對離子滲透率明顯高于C01．0植物，而高表達GT-4的轉(zhuǎn)基因株系的相對離子滲透率低于C01．0植物，表明GT-4蛋白確實參與了植物鹽脅迫的響應(yīng)過程。我們還發(fā)現(xiàn)，正常生長情

7、況下gt一4突變體的開花時間明顯晚于C01．0植株，而高表達GT-4的轉(zhuǎn)基因株系與Col一0植物開花時間沒有顯著差異。亞細胞定位結(jié)果表明該蛋白不僅定位在細胞核中，還定位在細胞質(zhì)中。原生質(zhì)體系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄活性分析表明GT-4具有轉(zhuǎn)錄激活活性，并且N端的轉(zhuǎn)錄激活作用最為顯著。DNA結(jié)合活性分析表明，GT-4蛋白可以與GT-3box、GT-3bbox和MRE4元件結(jié)合。同時，我們還檢測了Col一0，gt一4突變體和GT-4高表達株系中一些脅迫和開花相關(guān)的基因的表達情況。結(jié)果表明，RD29A、RAP2．6L、CORl5A、刀和SOCl的

8、表達量在突變體中是被下調(diào)的，在轉(zhuǎn)基因株系中上調(diào)，由此，我們認為GT-4蛋白可能是通過影擬南芥三螺旋轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫反應(yīng)中的功能研究響這些基因的表達來調(diào)控植物鹽脅迫和開花的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。此外，我們還借助酵母雙雜交的方法篩選了與GT-4蛋白有相互作用的蛋白TEM2(AP2／ERF類轉(zhuǎn)錄因子)。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中組成型高表達TEM2會導(dǎo)致植物嚴重的晚花的表型，但是TEM2參與的鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至今未有研究。因此，我們進一步探討了GT-4與TEM2蛋白相互作用參與植物鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。首先，我們用BiFC和Co．IP的方法進一步驗證了

9、GT-4蛋白確實可以與TEM2蛋白在體內(nèi)互作，并通過激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)二者共定位在細胞核中。表型分析發(fā)現(xiàn)tem2突變體在NaCI處理時較野生型植株表現(xiàn)得更為敏感。我們認為，GT-4可能通過與TEM2互作參與調(diào)控植物鹽脅的響應(yīng)和開花過程。對GT-3a和GT-3b也做了研