氨對肝硬化大鼠模型腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

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1、中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文氨對肝硬化大鼠模型腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響姓名：劉洪艷申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：傳染病學(xué)指導(dǎo)教師：王靜艷20030301率文摘要疆的、氨是弓l起J

2、盱性腦病(HE)的～種主要的異常代謝產(chǎn)物，高血氨是盡翦公認(rèn)的肝性腦病發(fā)病的一個重要的因素，有學(xué)者報告一些肝性腦病病人的黢CT可見髓顯的大腦皮質(zhì)萎縮，病理學(xué)檢查可見大腦或小腦季孛經(jīng)元消失，但其發(fā)生的病理學(xué)基礎(chǔ)尚不清楚，目前汪鴦實驗證睨氮可以弓l起體外培養(yǎng)胚胎大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本獗究擬應(yīng)用肝硬他動物模型，繪予氨負(fù)荷來研究氨對腦神經(jīng)纓胞凋亡的影響。廠f材料與方法＼實驗動物必健康雄性Wistar大鼠，根據(jù)4種不同

3、處理方法將太鼠隨機(jī)分成4組：正常對照組：不加外界干預(yù)因素；正常氨負(fù)荷對照組：實驗寒繪子氨負(fù)旖；實驗對照組：應(yīng)用四氯化碳制備肝硬化模型，不加釙界干預(yù)因素；實驗組：制備肝硬化模型，實驗?zāi)┙o予氮受蘩。備組大鼠在給予氨負(fù)荷裁及20分鐘后分別經(jīng)內(nèi)眥靜脈應(yīng)用抗凝管采斑并在半小對灰應(yīng)用vitrosAMON千片比色法測定囊氨值。繪藥屠2小時內(nèi)觀察大鼠的狀態(tài)，應(yīng)用角膜反射及翻轉(zhuǎn)反射起莓在與否判斷是否伴有翳性腦瘸的發(fā)生。2小B寸后處死大鼠，處死翦經(jīng)心臟采囊檢測谷囂轉(zhuǎn)氮酶(A腿)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)萃瑟總疆紅素(TBil)。處死屠立即取大艟及肝右時組織，應(yīng)用4％多聚甲醛露定。常規(guī)染龜顯微鏡觀察

4、肝膝組織的改變，以確定肝硬詫模型是否形成；鏡下觀察腦組織的形態(tài)改變，芽應(yīng)用末端脫氧核替酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的寒端標(biāo)記(TUNEL)法對石蠟包埋的腦組織進(jìn)行籍纓脆穗亡的檢測。DAB懇色后，纓駐核星深棕黃色染色的為箍亡細(xì)胞，予顯微鏡下計數(shù)凋亡指數(shù)(A1)。·1，結(jié)果1．實驗組中有3只大鼠角膜反射與翻轉(zhuǎn)反射消失，證明出現(xiàn)肝性腦??；正常對照組、正常氨負(fù)荷對照組及實驗對照組角膜反射與翻轉(zhuǎn)反射存在，均未出現(xiàn)肝性腦病。實驗對照組有5只生成腹水，實驗組有6只生成腹水。顯微鏡下觀察：實驗組及實驗對照組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生，有明顯硬化結(jié)節(jié)形成；正常對照組及正常氨負(fù)荷對照組肝臟結(jié)構(gòu)正常；實驗組與

5、各對照組腦組織均未見異常。2．分別比較實驗對照組及實驗組與正常對照組的ALT、AST、TBil及0分血氨水平，具有顯著性差異，說明動物模型組存在肝功能改變，血氨水平也高于正常。實驗組給予氨負(fù)荷后血氨值與正常氨負(fù)荷組、實驗對照組比較有明顯增高，經(jīng)檢驗具有非常顯著性差異(P<0．01)。實驗對照組腦細(xì)胞AI與正常對照組比較具有顯著性差異(P<0．05)；實驗組腦細(xì)胞AI與實驗對照組及正常氨負(fù)荷對照組比較具有非常顯著性差異(P<0．01)，其中發(fā)生HE的大鼠腦細(xì)胞AI都大于均數(shù)。討論肝性腦病是肝硬化晚期常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，它的發(fā)病機(jī)理目前尚未完全清楚，其中氨中毒理論是目前公認(rèn)的發(fā)病

6、機(jī)制之一。肝硬化病人肝功能逐漸惡化，肝內(nèi)外側(cè)支循環(huán)的建立使來自腸道的氨繞過肝臟直接進(jìn)入體循環(huán)，氨的生成增多而清除減少，使體內(nèi)氨水平逐漸升高，當(dāng)氨進(jìn)入腦組織時，可以干擾腦的能量代謝，影響Na+一K+一ATP酶的活性，破壞血腦屏障的完整性，干擾神經(jīng)遞質(zhì)問的平衡。目前研究證實凋亡蛋白酶激活因子一1(Apaf一1)是一種誘導(dǎo)凋亡的因子，它有一個結(jié)合ATP的位點，氨由于能夠干擾腦的能量代謝，這可能是氨引起肝性腦病的一個作用機(jī)制?！?·本研究應(yīng)用大鼠肝硬化動物模型給予氨負(fù)荷后發(fā)現(xiàn)：肝硬化大鼠血氨水平已高于正常，而且對氨負(fù)荷耐受性下降，給予氨負(fù)荷后，血氨水平則更顯著升高，再一次證實了氨在

7、HE中的作用。神經(jīng)細(xì)胞的死亡有二種方式：壞死和凋亡，后者是一種更輕微的、非炎癥的、依賴能量的細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞凋亡是一種生理調(diào)節(jié)機(jī)制，參與調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞分化及體內(nèi)正常的細(xì)胞更新，受細(xì)胞內(nèi)外因素的影響。近年來對細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理研究顯示，細(xì)胞凋亡是一個遺傳的程序性過程，是基因表達(dá)的結(jié)果，當(dāng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的組成成分發(fā)生突變或出現(xiàn)數(shù)量異常時，此過程可受到干擾，從而引起細(xì)胞增殖與死亡的平衡障礙，進(jìn)而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。許多研究證實一些神經(jīng)退行性疾病與神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)：如早老性癡呆，帕金森氏癥，脊柱肌肉萎縮，肌萎縮性側(cè)索硬化。本研究通過TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)腦細(xì)胞在正常情況下未加任

8、何處理因素時，也可發(fā)生少量的細(xì)胞凋亡；實驗對照組AI值與正常對照組之間比較具有顯著性差異，前者的血氨高于后者(P<0．01)，說明氨能夠引起肝硬化大鼠模型腦細(xì)胞凋亡；在給予氨負(fù)荷后，實驗組與實驗對照組相比，腦細(xì)胞凋亡指數(shù)有所增加，實驗組與正常給予氨負(fù)荷組比較，腦細(xì)胞凋亡指數(shù)也明顯增加，實驗組與以上比較的兩組血氨水平存在明顯差異，說明血氨越高，細(xì)胞凋亡越明顯。本實驗不僅進(jìn)一步證實氨是能夠誘發(fā)HE的一個因素，而且發(fā)現(xiàn)氨可以促進(jìn)肝硬化大鼠腦細(xì)胞凋亡。實驗組給予氨負(fù)荷后發(fā)生肝性腦病的大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù)都大于均數(shù)，說明肝性腦