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《小黃魚ACE抑制肽的分離純化鑒定及構(gòu)效關系研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、蔡麗麗小黃魚ACE抑制肽的分離純化鑒定及構(gòu)效關系研究摘要本文以小黃魚魚肉為原料,酶解法制取ACE抑制粗肽,然后經(jīng)過多步分離純化鑒定小黃魚ACE抑制肽,同時對ACE抑制五肽進行了構(gòu)效關系的研究,篩選得到新型ACE抑制肽,并研究其在細胞層面上的降壓機理,以期為ACE抑制肽的研究開發(fā)提供理論依據(jù)。小黃魚魚肉用胰蛋白酶酶解,經(jīng)過響應曲面(RsM)優(yōu)化,用RP.HPLC法測定得其體外ACE抑制活性,確定最優(yōu)工藝條件為:pH7.0,溫度50.09。C,時間16.44h,底物濃度5.57%,酶底比9.12‰。獲得的小黃魚ACE抑制多肽ACE抑制率達87.78%。以最佳酶解工藝條件下制得的小黃魚ACE
2、粗肽為原料,進行多步分離純化,純化步驟依次為:超濾(截留分子量3000Da)、SephadexG25分子篩層析和SephadexG10層析,并用LC.TOFMS鑒定活性最高組分,人工合成后測定其體;'bACE抑制活性。結(jié)果為:分子量小于3000Da的肽具有高ACE抑制活性,抑制率達98.1%,分離純化得到的組分3.3抑制率為69.49%,液質(zhì)鑒定得到兩個五肽,分別為HDHSE(IC50值=38.741lamolFL)和GENSQ(ICso值=65.377IJmol/L)。本研究收集文獻報道的63個ACE抑制五肽,用偏最小二乘回歸法建立起構(gòu)效關系(QSAR)模型,用留一法進行內(nèi)部驗證,小
3、黃魚ACE抑制肽進行外部驗證,并篩選出一種未報到的新型ACE抑制肽。結(jié)果如下:模型的交叉驗證相關系數(shù)Rev2為0.5752,且小黃魚ACE抑制肽活性的預測值和實驗值相差不大,有此可知,建立模型具有較強的預測能力。分析QSAR模型得出,ACE抑制五肽C.端起第一位氨基酸的電性參數(shù)和第二位氨基酸殘基疏水性指數(shù)對ACE抑制活性的影響起主要作用(正相關)。此外,運用模型預測出一種未見報道的新型ACE抑制肽——IWHDC,人工合成后測得其ICso值為19.179lunol/L。以QSAR模型篩選出的新型ACE抑制肽——IWHDC為原料,研究其對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的影響,測定了不同濃度肽對細胞增殖的
4、影響,以及細胞在氧化模型中(加入H202)對NO、MDA釋放量和NOS、SOD活性的影響。結(jié)果表明,IWHDC可能通過抑制內(nèi)皮細胞增殖,提高SOD,eNOS活性,增加NO的釋放及降低MDA的釋放來發(fā)揮降壓功效,說明了IWHDC不僅能發(fā)揮ACE抑制作用,同時能促進體內(nèi)的抗氧化,協(xié)同進一步促進血管舒張作用。關鍵詞:小黃魚;分離純化;構(gòu)效關系;IWHDC;降壓機理U揚州大學碩士學位論文AbstractInthispaper,smallyellowcroakerwasusedasbasicmaterialswhichhydrolyzedtopreparedACEinhibitorypeptid
5、es.Thentheproductwasintroducedtopurifiedandidentified.Meanwhile,wemadeaQSARreaserchofACEinhibitorypentapeptidesandscreenedanovelACEinhibitorypeptide,alsouseditinantihypertensivemechanismresearchatthecelllevelwiththehopethatwecanprovideatheoreticalbasisontheresearchanddevelopmentofACEinhibitorype
6、ptides.Theeffectofprocessconditionsontheangiotensin·Iconvertingenzyme(ACE)inhibitoryofsmallyellowcroakerhydrolysedwithtrypsinwereinvestigatedusingresponsesurfacemethodology(RSM).RP-HPLCmethodwasalsointroducedtomeasureACEinhibitoryactivityofhydrolysate.Resultsshowedthattheoptimalhydrolysisconditi
7、onswereasfollows:pH7.0,50℃ofhydrolysistemperature,16.5hofhydrolysistime,substrateataconcentrationlevelof5.6%andenzyme/substrateratioof9960.Theinhibitoryactivityofpeptidesobtainedundertheoptimalconditionswasupto87.36%.Thecrud