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1、卵巢回收時(shí)間和溫度卵母細(xì)胞采集方法卵泡大小卵丘細(xì)胞包被卵母細(xì)胞體外成熟的調(diào)節(jié)機(jī)制卵巢回收時(shí)間和溫度卵母細(xì)胞停留體外時(shí)間對成熟影響很大。卵巢回收時(shí)間越短越好，最好是離體2h內(nèi)將卵巢取回實(shí)驗(yàn)室。研究發(fā)現(xiàn)，母豬卵巢離體時(shí)間長短影響到體外成熟。與其他哺乳動物相比，豬卵子對溫度特別敏感，卵巢的回收溫度較高或較低，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)效果極差甚至是退化，較合適的回收溫度是到達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)維持在32~35℃當(dāng)卵巢回收溫度低于25℃,豬的卵母細(xì)胞將受到冷休克的打擊。卵母細(xì)胞采集方法卵母細(xì)胞的采集方法有抽吸法和切剖法。在從離體卵巢上采集卵母細(xì)胞時(shí)，因采集方
2、法不同，所得卵母細(xì)胞體外成熟率間存在一定的差異，如抽吸法成熟率（77.6%）低于切剖法（80.4%）。抽吸法和切剖法相比兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)。與抽吸法相比，切剖法雖然費(fèi)時(shí)，但極少破壞卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），這種采集方法更有利于COCs的生長發(fā)育（陳曉宇等，2002）。注射器抽取有腔卵泡要比用刀片割破所取卵母細(xì)胞的數(shù)目要少，但是符合取卵時(shí)間愈短愈好的原則，因其方便、干凈、簡捷而被普遍使用。但要注意選擇合適的注射器和針頭。通常10mL注射器加18號針頭是比較合適的。實(shí)踐發(fā)現(xiàn)10mL注射器實(shí)用操作性比5和20mL的好，抽取卵泡的速度也比較
3、快，特別是針頭的大小非常重要。針頭太大，卵母細(xì)胞流失很多，沒有足夠數(shù)量的卵母細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；針頭太小則抽取過程中卵丘細(xì)胞會大量的脫落，因?yàn)槁亚鸺?xì)胞對卵母細(xì)胞有重要的協(xié)同作用，卵丘細(xì)胞的脫落將不利于卵母細(xì)胞的體外成熟。卵泡大小不同卵巢上的卵泡大小不一樣，同一卵巢上的卵泡大小也不同。一般取直徑為3~6mm的為宜，其質(zhì)量較好，卵丘細(xì)胞形態(tài)好的較多，整體大小比較均勻，核成熟率為40.8%。哺乳動物大腔卵泡的卵母細(xì)胞、小腔卵泡的卵母細(xì)胞和原始卵泡都能完成體外成熟和體外受精，但卵泡的大小對卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育有重要影響。豬卵泡直徑直接影響卵母細(xì)胞體
4、外成熟率，成熟率較高的卵母細(xì)胞是來自中等直徑的卵泡，而小卵泡中的卵母細(xì)胞成熟率明顯下降。來自大卵泡的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)退化嚴(yán)重（王海，2002）。孟慶剛等（2001）研究了由2mm以下豬卵泡獲得的小、中、大三類卵母細(xì)胞，培養(yǎng)48h的成熟率分別為0、22.31%和45.45%。2mm以下卵泡卵母細(xì)胞的成熟率（52.63%）顯著低于2~6mm卵泡卵母細(xì)胞的成熟率（80.39%）豬卵泡直徑只有達(dá)到2mm以上，其卵母細(xì)胞才具備體外成熟的能力，小腔卵泡中的卵母細(xì)胞缺乏進(jìn)一步發(fā)育所需的關(guān)系因子，大卵泡中卵母細(xì)胞的退化可能與其過早成熟而發(fā)生老化有
5、關(guān)。卵母細(xì)胞的分級包裹在卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞的層數(shù)也影響著卵母細(xì)胞的體外成熟。不同的研究者對卵母細(xì)胞的分類不盡一致。根據(jù)卵母細(xì)胞外卵丘細(xì)胞的有無和層數(shù)，豬卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體分5級[5]。A級：擴(kuò)展且顏色較暗，卵丘細(xì)胞有5層以上包裹的胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞；B級：卵丘細(xì)胞顏色較淺且稀疏的，卵丘細(xì)胞有5層以上包裹的胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞；C級：有3～5層卵丘細(xì)胞緊密包裹的均勻胞質(zhì)卵母細(xì)胞；D級：卵丘細(xì)胞稀少，胞質(zhì)不均勻；E級：裸卵、黑卵。A、B級可以用于體外成熟培養(yǎng)，一般成熟率較高，而C、D級則效果較差，E級不能用于體外培養(yǎng)。卵丘細(xì)胞包被卵丘
6、細(xì)胞質(zhì)量是影響卵母細(xì)胞體外成熟的重要因素之一。卵母細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)依賴卵丘細(xì)胞提供，兩者間還通過縫隙連接進(jìn)行信號傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長和成熟。裸卵僅能夠利用周圍介質(zhì)中的丙酮酸和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，不能直接利用葡萄糖。卵丘細(xì)胞可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，為卵母細(xì)胞的生長和發(fā)育提供能量。如果兩者間縫隙連接被過早破壞，卵母細(xì)胞可能停止發(fā)育（鄭行，1994）。卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞離體后至受精前的成熟培養(yǎng)期間里對卵母細(xì)胞自身的成熟起著很大作用，從而影響到隨后的受精及卵裂過程，而這個(gè)作用是隨著卵丘細(xì)胞層數(shù)的增加而提高（楊膺白等，1994）。F
7、SH、LH通過作用于卵丘細(xì)胞上的受體，傳遞信號或分泌活性物質(zhì)，作用于卵母細(xì)胞，調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育（Byskov等，1997）。說明卵丘細(xì)胞包裹對于卵母細(xì)胞體外成熟有積極作用。在卵母細(xì)胞的體外成熟過程中，卵母細(xì)胞成熟率和成熟的質(zhì)量，取決于卵丘細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量。在卵母細(xì)胞體外成熟研究中，一般根據(jù)卵丘細(xì)胞的數(shù)量和擴(kuò)張的程度分為4種類型：即包繞3層以上緊密卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞為第1類；3層以下的為第2類；卵丘細(xì)胞擴(kuò)展而疏松，卵母細(xì)胞卵質(zhì)無斑塊的為第3類；無卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞（裸卵）為第4類。李麗立等（2002）對這4類卵母細(xì)胞體外成熟研究結(jié)果表明
8、，達(dá)到MII期的成熟率分別為93%、90%、76%、20%，成熟效果依次遞減。因?yàn)樵诓溉閯游锫涯讣?xì)胞成熟研究中發(fā)現(xiàn)，處于靜止期的初級卵母細(xì)胞在激素的作用下，若沒有卵丘細(xì)胞的存在則卵母細(xì)胞不能成熟?？梢娫诼涯讣?xì)胞成熟發(fā)育時(shí)
